DNA和RNA提取常见问题分析及对策..

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,和,RNA,提取常见问题分析及对策,其次局部：DNA提取常见问题分析及对策,DNA提取专题,第一局部：DNA提取方法简介,前言,DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学争论的主要对象。为了进展测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是特殊重要的前提。,DNA提取原则,保证DNA构造的完整性,纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质,排解有机溶剂和金属离子的污染,蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度,排解其他核酸分子的污染,DNA提取的几种方法,染色体,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,其它,DNA提取的几种方法,非染色体,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,煮沸法,线粒体、叶绿体,DNA,的提取,差速离心结合,SDS,裂解法,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理植物DNA提取经典方法,CTABhexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中0.7mol/L NaCl是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参与乙醇沉淀即可使核酸分别出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其参与冰冷的,植物材料之前必需预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB,提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl pH8.0供给一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；,NaCl 供给一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；,CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分别；,-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避开褐变，使酚简洁去除,基因组DNA CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，削减DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB,法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,枯燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNA CTAB法,SDS,法原理,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温5565条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度冰浴，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法流程图 以动物组织为例,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNASDS法,基因组DNA其它方法,物理方式,：玻璃珠法、,超声波法、研磨法、冻融法,化学方式,：异硫氰酸胍法、碱裂解法,生物方式,：酶法,依据细胞裂解方式的不同有：,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法：,依据核酸分别纯化方式的不同有：,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。,快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。,适用于纯度要求高的试验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。,基因组DNA其它方法,浓盐法,：,有机溶剂抽提法,：,密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分别,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；,当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA简洁发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其自然构象；,变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,枯燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；,当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA简洁发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其自然构象；,变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分别混合物的一种方法。,将待分别物质置于均匀介质蔗糖中，以确定的转速进展离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分别。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小确定，因而在同一离心场内的沉降速度也确定，依据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分别出来。,第一局部：DNA提取方法简介,内容,其次局部：DNA提取及常见问题分析,DNA提取的根本步骤,I.材料预备,II.裂开细胞或包膜内容物释放,III.核酸分别、纯化,IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质,V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料预备,最好使用新颖材料，低温保存的样品材料不要反复冻融,提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞白细胞,组培细胞培育时间不能过长，否则会造成DNA降解,含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新颖菌体老化菌体导致开环质粒增加,培育时应参与筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丧失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接质粒丧失,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致,DNA,量少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶,K,细菌溶菌酶破壁,酵母破壁酶或玻璃珠,高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当,培育基去除洁净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮,变性的时间不要过长5分钟，否则质粒易被打断,复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染,G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分别、纯化,承受吸附材料吸附的方式分别DNA时，应供给相应的缓冲体系,承受有机酚/氯仿抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分别两相时，应保证确定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸分别、纯化,蛋白质的去除：,酚/氯仿抽提,使用变性剂变性SDS、异硫氰酸胍等,高盐洗涤,蛋白酶处理,多糖的去除：,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。,用多糖水解酶将多糖降解。,在提取缓冲液中加确定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。,用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中参与200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。,核酸分别、纯化,多酚的去除：,在抽提液中参与防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,参与易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,核酸分别、纯化,盐离子的去除：,70,的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时参与1/10体积的NaOAcpH5.2，3M，有利于充分沉淀,沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干DNA，让乙醇充分挥发不要过分枯燥,假设长期储存建议使用TE缓冲液溶解,TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase,pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,基因组DNA的检测,提取的基因组,DNA,片段在,20kb,30kb,之间,高质量的基因组,DNA,带型 单一无拖尾现象,DNA,浓度及纯度的检测,A,260,=1,约,50,g/,mL,双链,DNA,；,A,260,/,280,约为,1.8,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反响。,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反响,DNA中残留有金属离子,有RNA的存留,缘由,对,策,重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀DNA，让酒精充分挥发,增加70乙醇洗涤的次数2-3次,参与RNase降解RNA,DNA提取常见问题,问题二：,DNA,降解。,材料不新颖或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于猛烈，DNA被机械打断,外源核酸酶污染,反复冻融,缘由,对,策,尽量取新颖材料，低温保存材料避开反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前参与裂解缓冲液,在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,全部试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将DNA分装保存于缓冲液中，避开反复冻融,DNA提取常见问题,问题三：,DNA,提取量少。,试验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,吸附或沉淀不完全,洗涤时DNA丧失,缘由,对,策,尽量选用新颖幼嫩的材料,动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长对于动物细胞、细菌可增加PK的用量。,增加吸附的时间，或低温沉淀,留神操作,RNA提取专题,其次局部：RNA提取及常见问题分析,第一局部：RNA提取方法简介,分别提纯RNA的目的,分析不同发育时期基因的表达状况,获得新基因,争论基因的拼接,分析相应的蛋白产物,RNA的不稳定性,由于核糖残基的,2,和,3,位置带有羟基，,RNA,易于被,RNA,酶切割水解,RNA,酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,提取RNA的留意事项,常常更换新手套。由于皮肤和试验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染。,使用灭过菌的塑料制品和枪头避开穿插污染。,应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。,常用RNA酶抑制剂,焦磷酸二乙酯DEPC： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，猛烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。,异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞构造使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有猛烈的变性作用。,氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。,RNA酶的蛋白抑制剂RNasin：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。,其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有确定抑制作用。,RNA提取专题,其次局部：RNA提取及常见问题分析,第一局部：RNA提取方法简介,RNA提取的步骤,材料的裂解,杂质的去除,RNA的吸附或沉淀,异硫氰酸胍,，,亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。,苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使DNA及蛋白沉淀到有机相。,硅质材料的吸附,或用异丙醇沉淀浓缩RNA。,经DEPC 处理的水溶解RNA,材料预备及裂解,尽量使用新颖材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。,组培细胞及血液应尽量离心去除培育液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。,对不能马上提取的样品切成小块后立刻投入液氮冷冻，或投入特地的RNA样品储存液中保存。,液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；参与裂解液并且彻底而快速地匀浆。,RN,A的提取,杂质的抽提,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和,DNA,分布到中间层和有机相中，,RNA,留在水相中,对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提,RNA的提取,RNA的沉淀和溶解,含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质,或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀，70乙醇洗涤，晾干,用经DEPC处理过的水或特地的试剂来洗脱或溶解RNA,样品收集后或需长期保存时应置于70 或参与RNase抑制剂，分装使用,RNA的提取,RNA的检测,电泳槽系统的处理,乙二醛化琼脂糖凝胶电泳,含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳,RNA纯度及浓度的检测,A260=1 ，约40 g/ mL RNA；,A260/A280 约为1.9-2.1 ,1 抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染,2 DNA 的污染,3 离子浓度较高,缘由,对,策,1 保证彻底的裂解和确定转数确定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化,2 削减处理样品的量；参与不含RNase的DNase处理；再次纯化,3 增加漂洗次数,RNA提,取常见问题,问题一：,RNA,样品不纯,1 样品含有杂质杂液,2 样品过量或样品裂解,和匀浆不彻底,3 RNA未有效的吸附沉淀或洗脱,4 样品RNA含量少,缘由,对,策,1 去除样品中的杂质，离心除净样品中的培育基或储存液,2 削减样品用量；充分研磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间,3 延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间；再次洗脱,4 重复吸附，参与肝糖等有助RNA沉淀的试剂,RNA提,取常见问题,问题二：,RNA,得率低,1 样品不新颖或样品保存不当，RNA降解,2 污染了RNase,3 样品储存不当,缘由,对,策,1 尽量取新颖的样品；取样后立刻放入液氮保存；或放入特地的储存液内；研磨样品准时补充液氮,2 认真地处理相应的器具和试剂；严格地操作,3 -70 冻存，分装使用；参与RNase抑制剂,RNA提,取常见问题,问题三：RNA简洁降解,