免疫组化技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1/10/2022,#,免疫组化技术,免疫组化技术,第1页,组织化学基础概念：,组织化学：,组织水平，对组织内存在各种物质进行定性、定量以及其局部和移动部位分析方法,免疫组织化学：,基于抗原抗体反应,酶组织化学,免疫组化技术,第2页,疾病病理学研究概括起来主要在,基因,和,蛋白,水平上进行研究。,免疫组织化学,方法主要用于基因,蛋白质,水平表示研究。,蛋白表示,=,分布，定位，定量；,蛋白表示与与肿瘤生物学行为及预后关系等,免疫组化技术,第3页,材料：,抗体：,多克隆抗体,：为针对多个抗原决定簇抗 体，为产生抗体动物血清或免疫球蛋白。,单克隆抗体,：为一个,B,淋巴细胞分化增殖产 生抗体，可识别有限抗原决定簇，特异 性强。,免疫组化技术,第4页,显示物：,酶标反应：,碱性磷酸酶,（,Alkatine phasphotase,AP,）,AP,与不一样底物（萘酚,As-Mx,、快蓝、快红）作用，可形成不一样颜色终产物。用新品红（,New fuchsine,）显色，可形成不溶于有机溶剂红色沉淀，不褪色。,辣根过氧化酶,(Horseradise peroaidase,),HRP,：底物为,DAB,四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。,免疫组化技术,第5页,HRP,免疫组化技术,第6页,AP,HE,免疫组化技术,第7页,荧光标识：荧光素标识抗体,异硫氰酸荧光素（,Fluorescien isothioyarale,FITC,）,520,530nm,四甲基异硫氰酸罗达明（,Teramethyle rhodamine isothiecyanata,TRITC,）,620nm,四乙基罗达明（,Teraethyle rhodamine B200,RB200,）,590,600nm,免疫组化技术,第8页,免疫组化技术,第9页,胶体金：,指金水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，,免疫电镜观察,免疫组化技术,第10页,主要方法：,直接法：,间接法：,经过了第二抗体放大效应,PAP,法：,以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，经过第二抗体桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。,免疫组化技术,第11页,免疫组化技术,第12页,ABC,法：,生物素,（,Biotin,）和,卵白素,（,Avidin,）为含有高度亲合性物质，一个卵白素分子可结合,4,个生物素。当生物素标上特定标识物质后,or,与抗体结合后仍能与卵白素结合，所以，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标识物生物素结合反应，而以适当方式显示。,免疫组化技术,第13页,S-P,法（,LSAB,）：,采取生物素标识第二抗体与链霉素生物素蛋白连接过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中抗原。,免疫组化技术,第14页,Envision,法（二步法）：,原理：第二抗体上标识有多聚物酶（,HRP or AP,）复合物与第一抗体结合。二抗上多聚物可结合许多,HRP,分子，使信号有显著提升，敏感性较,PAP,法，,ABC,法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。,免疫组化技术,第15页,以,LSAB,法为例简单介绍染色步骤：,石蜡切片脱蜡水；,3%H,2,0,2,抑制内源性过氧化物酶,15min,；,每张切片加,10-20ul,非免疫性动物血清，室温孵育,5min,；,加特异性一抗，,37,0,C,孵育,30,60min,，,or 4,0,C,过夜；,加,20ul,生物素标识第二抗体，,370C,，,30min,；,免疫组化技术,第16页,加过氧化物酶标定链菌素亲生物素，,37,0,C,，,30min,；,以上每步后均用,PBS,液洗,33min,；,用过氧化物酶基质液（,DAB,基质液）显色,5,15min,。在光镜下观察。,自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝，梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。,免疫组化技术,第17页,免疫组化常见问题处理：,组织材料处理：,固定液为：,10%,中性福尔马林液；,4%,多聚甲醛磷酸缓冲液（,PH7.4,）；,固定时间：,8-24hr,组织大小：,2*1.5*0.3cm,免疫组化技术,第18页,防脱片处理：,多聚,-L-,赖氨酸；,硫酸铬钾明胶液。,免疫组化技术,第19页,增强特异性染色办法和方法：,1,）蛋白酶消化：,a,、胰蛋白酶消化,（,0.05-0.1%,）；,b,、胃蛋白酶消化（,0.4%,）。,2,）热诱导抗原修复：,方法：微波,96,0,C,10min,；,直接加温方法,100,0,C,10min,；,高压锅,120,0,C,10min,；,热处理液：,0.01mol/L PH6.0,柠檬酸缓冲液,免疫组化技术,第20页,适当抗体稀释度：,过高，过低均会造成阴性结果。,即用型抗体；,浓缩型。,免疫组化技术,第21页,降低或消除非特异性染色方法：,非特异性染色：,原因：,方法：,免疫组化技术,第22页,免疫组化技术,第23页,对照：,阳性对照：,用一直抗原阳性切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。,阴性对照：,用不含一直抗原标本作对照，试验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包含空白对照、替换对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。,免疫组化技术,第24页,染色,特异性染色,非特异性染色,显色部位,特定细胞或间质,细胞和间质均匀染色或更强,显色定位,特定，含有结构性,无特定部位，无结构性,显色程度,同一部位呈不一样程度显色,无分布规律，某一片均匀着色,免疫组织化学结果判断应非常严谨，阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反应出抗原浓度，并以此作为定性、定量和定位依据。,阳性细胞染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有显著间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，二者可显著区分。,免疫组化技术,第25页,阳性细胞染色特征：,阳性细胞染色分布有三种：,胞浆；细胞核；细胞膜表面,阳性细胞分布：,灶性；弥漫性,染色强度不一,切片边缘，刀痕,or,组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同阳性染色强度。,对于阳性结果定量判断：,-,，,+,，,+,，,+,等分级和计数统计,免疫组化技术,第26页,垂体腺瘤,ACTH,免疫组化技术,第27页,乳腺癌,c-erbB-2,免疫组化技术,第28页,免疫组化,A,细胞,B,细胞,D,细胞,免疫组化技术,第29页,上皮性肿瘤标识,上皮膜抗原（,EMA,）：,广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。,癌胚抗原（,CEA,）：,主要存在于胎儿消化道上皮，,胰腺以及绝大个别内脏癌。,前列腺特异性抗原（,PSA,）：,甲胎蛋白（,AFP,）：,甲状腺球蛋白（,Tg,）：,免疫组化技术,第30页,软组织标识,软组织：全身各处纤维结缔组织，脂肪组织，,肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。,肌动蛋白（,Actin,）：分布于全部肌型细胞中,肌红蛋白（,Myoglobin,）：是骨骼肌肌浆中一个,可溶性蛋白，含有较高组织特异性。,免疫组化技术,第31页,内皮细胞标识,CD34,：主要标识内皮细胞；,亦可用于各种肿瘤间质中血管生成研究。,第八因子相关抗原（,Factor-related antigen,F-RAg,）：,血管瘤阳性表示程度强于血管肉瘤。,CD34,优于,F-RAg,。,溶菌酶（,Lysozyme,）：为组织细胞及其肿瘤标识物。,抗胰糜蛋白酶（,AAcT,）：主要用于恶纤组诊疗。,免疫组化技术,第32页,淋巴细胞标识物,：,白细胞共同抗原（,LCA,CD45,）：主要分布于,T,B,细胞，,单核细胞，粒细胞表面。,CD20,：,B,细胞标识物。,CD45RO,、,CD3,：,T,细胞标识物。,CD57,：为自然杀伤细胞标识物。,CD38,：为浆细胞标识物。,CD68,：主要标识各种组织中巨噬细胞。,免疫组化技术,第33页,神经内分泌标识物：,嗜铬素,A,（,Chromogranin,CgA,）：,存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。,突触素（,Synaptophysin,Sy,）：,存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，,神经内分泌细胞中。,髓磷脂硷性蛋白（,Myelin basic protein,MBP,）：,免疫组化技术,第34页,激素及激素受体类标识：,雄激素受体（,Androgen receptor,AR,）：,雌激素受体（,Estrogen receptor,ER,）,孕激素受体（,Progesterone receptor,PR,）：,垂体激素：,ACTH,GH,PRL,LH,TSH,主要用于垂体腺瘤功效分类。,降钙素（,Calcitotin,CT,）：,甲状腺旁细胞（,C,细胞）分泌。,免疫组化技术,第35页,以上抗体及标识物主要用于疾病病理诊疗和判别诊疗,其联合应用作用和意义：,Keratin,Vimentin,上皮性肿瘤,Keratin,滑膜肿瘤,Vimentin,间皮肿瘤,上皮样肉瘤,癌肉瘤,免疫组化技术,第36页,Des,or Actin,肌源性肿瘤,CD34,or F,血管性肿瘤,Keratin,S-100,or MBP,神经鞘膜瘤,Vimentin,LCA,淋巴细胞,AACT,骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤,GFAP,胶质细胞肿瘤,Keratin,NSE,or Sy,Vimentin,NF,节细胞神经母细胞瘤,免疫组化技术,第37页,免疫组化用于病理诊疗及判别诊疗标准：,免疫组化用于病理诊疗及判别诊疗，必须以,HE,染色,形态学为基础，免疫组化只能作为辅助伎俩。不能把,免疫组化染色作为诊疗“金标准”。,免疫组化对良、恶性判断仅供参考。,免疫组化用于判断组织起源，分型，预后预计。,免疫组化染色不好或出现相互矛盾结果时，以形态学为准。,免疫组化技术,第38页,涂片,免疫组化技术,第39页,磨片,骨,bone,免疫组化技术,第40页,电子显微镜技术：透射电镜,免疫组化技术,第41页,透射电镜,扫描电镜,电子显微镜技术,免疫组化技术,第42页,透射电镜,扫描电镜,免疫组化技术,第43页,固定：,为了尽可能保留样本原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇酸来染色。,冷固定：将样本放在液态乙烷中速冻，这么水不会结晶，而形成非晶体,脱干：,使用乙醇和丙酮来取代水。,包埋：,树脂,超薄切片：,将样本使用金刚石刃切成薄片。,染色：,重原子如铅或铀比轻原子散射电子能力高，所以可被用来提升对比度。,免疫组化技术,第44页,