食品常见有害物质的测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,食品常见有害物质的测定,1,概述,2,食品中有机磷农药残留量的测定,3,食品中黄曲霉毒素的测定,食品中常见有害物质的测定,有害物质成分：,农药、黄曲霉毒素、苯并比、亚硝胺类化合物、苯酚、多氯联苯、动植物毒素、氰化物、重金属元素、非金属元素、添加剂、激素、抗生素、兽药,食品中农药残留量的测定,农药：农业生产中使用的各类农药。常用的有有机氯农药和有机磷农药2大类。,农药残留：指未分解而留存于土壤作物及环境进而留存与食品的农药。,测定方法：2003年新制定的食品卫生检验方法增加了42种测定农药的方法。用得较多的是气相色谱法，其次是高效液相色谱法、分光光度法。,一、有机氯农药残留量的测定,（GB/T5009192003）,方法：,第一法 气相色谱法,第二法 薄层色谱法,有机氯农药的提取步骤：,有机溶剂（丙酮、石油醚）提取,净化,浓缩,食品中有机磷农药残留量的测定,测定方法多，最有代表的：,GB/T5009202003：,第一法：水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留的测定该法采用的是气相色谱法，可检测20种有机磷农药。,第二法：粮、菜、油中有机磷农药残留量的测定。该法采用的也是气相色谱法，可检测9种有机磷农药。,两者区别：用不同的色谱分离柱。,GB/T50091992003,（蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测）：,速测卡片（纸片法）,酶抑制率法（分光光度法）,本法为定性检验方法，因为速度快，广泛使用中。,原理,胆碱酯酶,底物,（,碘化硫代乙酰胆碱,）,+显色剂,（,二硫代二硝基苯甲酸,）,有色物质,PH8.0,无农药，胆碱酯酶催化能力强，显色深。,有农药，胆碱酯酶催化能力弱，显色浅。,吸光度变化小，与对照溶液的吸光度差值大，抑制率大，农药含量高。,试剂,仪器,测定步骤,样品处理,对照溶液的吸光度变化值测定,A,0,=A,3min,A,开始,样品液的吸光度变化值测定,A,t,=A,3min,A,开始,结果计算与判断,A,0,A,t,抑制率（%）=100,A,0,若抑制率50%为阳性结果，抑制率越大，农药残留量越高。,第二节 食品中黄曲霉毒素的测定,一、有关知识,黄曲霉毒素：AFT,分类：AFTB、AFTG,特征：,（1）性质特征,污染粮油及其制品,对光、热、酸稳定，对碱和氧化剂不稳定,（2）结构特征：含二呋喃环、香豆素,（3）测定方法：,薄层色谱法,牛清抗体反应显色法,微粒筛选法,二、黄曲霉毒素B1（AFT B1）测定,（GB/T5009222003）,第一法 薄层色谱法,第二法 牛清蛋白抗体反应显色法,薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1测定,1、原理,样品中AFT B1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长365nm紫外光下产生荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B1最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B1的含量。,2、,试剂,三氯甲烷（AR）,正己烷（AR 沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）,甲醇（AR）,苯（AR）,乙腈 （AR）,无水乙醚（AR）,丙酮 （AR）,(以上试剂应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰）,苯-乙腈(98:2)混合溶液,甲醇-水（55:45）混合溶液,三氟乙酸（AR）,氯化钠（AR）,无水硫酸钠（AR）,硅胶G（薄层色谱用）,5%次氯酸钠：称取100g漂白精，加入500mL水，搅匀。另将80g工业用碳酸钠（Na,2,CO,3,.10H,2,O）溶于500mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，用作消毒剂。,黄曲霉毒素B1标准贮备液,：,用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFT B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置于4冰箱中保存。使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。（在350nm测定AFT B1的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度）。,黄曲霉毒素B1标准应用液I（1ug/mL）,：,吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。,黄曲霉毒素B1标准应用液II（0.2ug/mL）,：,吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。,黄曲霉毒素B1标准应用液III(0.04ug/mL),：,吸取1.0mL 0.2ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。,3、,主要仪器,玻璃板：520cm,涂布器,色谱展开槽（2564cm）,紫外光灯：100-125W，带有波长365nm滤光片,微量注射器：20uL,10uL各一支,4、,操作步骤,、样品预处理,称取4g混匀的花生油样品于小烧杯中，用20mL石油醚或正己烷，将其转移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇-水溶液移入第二分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重复提取一次，提取液并入第二分液漏斗中。在第二分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，振摇2分钟，静止分层后，放出三氯甲烷层，经盛有约10g先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次，三氯甲烷层一并滤入蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并入蒸发皿中。在通风柜中，将蒸发皿于65水浴上挥干，然后放入冰盒上泠却2-3分钟，准确加入1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的管尖将残渣充分混合，若有结晶析出，将蒸发皿取下，继续溶解、混匀，晶体消失后用滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。,、样品测定,1薄层板的制备,称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分钟，至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成520cm、厚度为0.25 mm的薄层板三块。于空气中干燥约15分钟后，在100下活化2小时，取出放入干燥器中保存。,2点样,将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3cm的基线上用微量注射器滴加样液和标准液：,第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B1 标液,第二点：20uL样液,第三点：20uL 样液+10uL 0.04ug/mL AFT B1 标液,第四点：20uL 样液+10uL 0.2ug/mL AFT B1 标液,要求点距边缘和点间距约为1cm,样点直径约3cm,大小相同，点样时可用电吹风冷风边吹边点。,3展开,在展开槽内加10mL无水乙醚，将点好样的薄层板预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL 丙酮+三氯甲烷（8+92）混合溶剂，展开10-12cm，取出挥干。,4结果观察,将展开好的薄板放在365nm的紫外灯光下观察：a.若第一点无荧光或都无荧光。说明薄板或展开剂未制备好，需重新制备。b.第一点有荧光，而其余三点无荧光。说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。c.第一点有荧光，第二点无荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFT B1或含量小于最低检出量。d.四个点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。,5确证实验,于另一薄板上左边依次点二个样：,第一点：10uL0.04ug/mL AFT B1标液,第二点：20uL样液,在以上两点各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反应5分钟后，用电吹风热风2分钟，使温度不高于40。,再于薄层板的右边点以下二个点：,第三点：10uL 0.04ug/L AFT B1 标液,第四点：20uL样液,同第3步展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFT B1标准点相同的衍生物AFT B2a,未加TFA的第三、四点作空白对照。,6稀释定量,若第二点的荧光强度比第一点强，则根据其强度估计减少点样体积，于另一薄板上点四个点：,第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B1标液,第二点：10uL 样液,第三点：15uL 样液,第四点：20uL 样液,展开后取荧光强度与第一点相同的样点进行计算。,5、,计算,V1 D,X=0.0004 ,V2 m,X 样品中AFT B1 的含量ug/kg(ppb),V1稀释前样液的总体积mL,V2出现同等荧光强度的稀释后样液点样量uL,D 样液的稀释倍数,