猪胰脏制备

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,动物胰蛋白酶的制备及活力的测定,一、生物大分子制备概述,生物大分子主要是指蛋白质、多糖和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、多糖和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的努力。,生物材料的组成极其复杂，,常常包含有数百种 乃至几千种化合物。,生物大分子在生物材料中的含量极微。,只有万分之一、几十万分之,一，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目,的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例,如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的,生物 材料，才能提取出几毫克的样品。,生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活。因此分离过,程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。过,酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物,大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条,件。,生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、,pH,值、离子强,度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判,断。,与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：,1.,确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、生产还是要发现新的物质。,2.,建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的,“,眼睛,”,。,3.,通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。,4.,生物材料的破碎和预处理。,5.,分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程,6.,生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或,HPLC,和毛细管电泳都是一个峰。,7.,产物的浓缩，干燥和保存。,生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：,二、生物大分子制备的前处理,（一）,生物材料的选择,制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。,材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。,从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料。,从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。除此之外，选材还应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。,材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。,（二）细胞的破碎,1,机械法：,1),研磨,将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。,2),组织捣碎机,这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转,10,秒,20,秒，停,10,秒,20,秒，可反复多次。,2,物理法：,1),反复冻融法,将待破碎的细胞冷至,15,到,20,，然后放于室温,(,或,40),迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。,2),超声波处理法,此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。,3),压榨法,这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在,1000 105Pa,2000105Pa,的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器用较高。,4),冷热交替法,从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在,90,左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。,3,化学与生物化学方法：,自溶法,将新鲜的生物材料存放于一定的,pH,和适当的温度下，,细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯,酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，,此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解,酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些,要提取的有效成分分解了。,2,）溶胀法,细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐,溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细,胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。,3),酶解法：,利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于,37,，,pH8,，处理,15,分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒,DNA,时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛），将酵母细胞悬于,0.1mmol/L,柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液,(pH=5.4),中，加,1,蜗牛酶，在,30,处理,30,分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入,0.2,疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨法联合使用。,4),有机溶剂处理法：,利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或,SDS,（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。,（三）,生物大分子的提取,“,提取,”,是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。,1,水溶液提取：,蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。,用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：,盐浓度（即离子强度）：,绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“,盐溶,”现象。但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“,盐析,”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多数生化物质的提取。通常使用,0.02 mol/L,0.05 mol/L,缓冲液或,0.09 mol/L,0.15 mol/L NaCl,溶液提取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同，为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入,KCl,、,NaCl,、,NH4Cl,或,(NH4)2SO4,）可以增加溶液的极性。,2)pH,值：,蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与,pH,值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在,pH=6,8,范围内，提取溶剂的,pH,应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧，酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白质的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛,-3-,磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则常用稀碱来提取。,3),温度：,为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在,0,5,的低温操作。但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利于提取和下一步的纯化。,2,有机溶剂提取,一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。,其中正丁醇在,0,时在水中的溶解度为,10.5,，,40,时为,6.6,，同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。,三、生物大分子的分离纯化,1.,沉淀法,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：,中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。,蛋白质和酶均易溶于水，因为这些分子的,COOH,、,NH2,和,OH,都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成,1nm,100nm,颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。,盐析的操作方法,最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。,有机溶剂沉淀,：,多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。,选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：,多用于除去某些不耐热的和在一定,pH,值下易变性的杂蛋白。,等电点沉淀,：,用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。,有机聚合物沉淀：,是发展较快的一种新方法，主要使用,PEG,聚乙二醇（,Polyethyene glycol,）作为沉淀剂。,未得到充分的证实解释主要有：认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。本方法的优点是：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的,PEG,即可以沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。,2.,分离纯化方法的选择,生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。,制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。,从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节,pH,以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋