限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑文本,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑文本,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,PPT,制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓,限制性核酸内切酶,切割原理、方法、结果分析及应用,课堂内容回顾,：,1,、定义：,1,、定义：,限制性核酸内切酶,是可以识别,特定的,核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,进行切割的,一类酶,，简称限制酶。,2,、分类：,（根据酶的基因、蛋白质结果、依赖的辅助因子及,DNA,裂解的特异性，将限制性内切酶分为三种类型）,型酶：具有,DNA,修饰的作用在非特异位点处切割,DNA,。型酶：是最重要的工具酶,能在,DNA,分子内部的特异位点识别和切割,DNA,双链，所 以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。型酶：与型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测,型酶：具有,DNA,修饰的作用在非特异位点处切割,DNA,。,型酶：,是最重要的工具酶,能在,DNA,分子内部的特异位点识别和切割,DNA,双链，所 以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。,型酶：与,型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测。,3,、命名：,规则,：,第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名,第二、三个字母（小写）：该细胞的种名,第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号,例如：,EcoR,、,Hind,等等,限制性核酸内切酶切割原理,1,、类和类酶：,在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。,2,、类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，产生,5,或,3,黏性末端（也有一些产生平端或钝端）,几种限制性内切酶的切割位点,例如：,3,、同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。如：,BamH,和,Bst,，,Xho,和,Pae R7,等可以相互代替使用。,4,、同尾酶：识别序列不同，但产生相同末端的限制性内切酶。如：,BamH,和,Sau3A,等由此产生的,DNA,片段可借黏性末端相互连接，操作是具有更大的灵活性。,通,过 使 用(,15,种)限 制 性 内,切 酶 酶 切 重 组质粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法o,方法：,1.,质粒的构建,采,用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出 MLCKcDNA,片,段，插入质粒 pBKrsv中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒,2.,酶切、构建、片段的纯化和连接,按Maniatis等方法进行,。,3.,重组质粒的转化,转化采用,“,热休克,”,法,。,4.,重组质粒的提取,挑取阳性克隆，在LB培养基中培养，采用碱裂解法提取重组质粒,。,5.,定量,取5,L,DNA溶液用4,.5,l,去离子水稀释，用紫外分光光度计比色，读取AZ60和AZ80吸光度值,，,计算出AZ60/AZ80比值，按下列公式计算质粒DNA浓度,本实验中质粒DNA浓度为1.0g/L,。,质粒 DNA 浓度(g/L)=AZ60X稀释度/Z0=AZ60X5,6.,重组质粒的限制性核酸内切酶酶切,取,0.5ml,离,心管,15,只,，,分别加入质粒,2,l(,2,g)，依 次 加 入 限 制性内 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、,H,ind皿、EcoR I各0.5微升及相 应的 NEBuffer,2,L,、BSA,L,、去离子水 13.5,L,、混匀、点动离心，37 水浴孵育,2,小时。,7,、,配置1.5的琼脂糖凝胶,称取琼脂糖,0.6g,加入 1XTAE 缓 冲 液 40 ml置 微 波 炉 中,中 火,120s,，熔化后冷却至,60,，加入,3,L10g/l,溴化乙锭，混匀，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入电泳槽中。电泳槽中加入,1TAE,缓冲液。,8,、,电泳,取酶切产物,8,l与,DNA,上样缓冲液,2,l混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可观察到橘红色,DNA,条带，结果如图,Lorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipisicing elit.,结果,重组质粒pBKrsv-MLCK 全长7378bp,，,通过 DNAstar软件分析获得各酶酶切位点的信息,，,选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点，计算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切酶酶切后，获得不同大小的片段，经电泳分析与理论设计完全一致,。,结果分析,限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向,(,orientation,)l,在选择限制性内切酶时,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要,。,在进行限制性内切酶实验时首先应进行,DNA,的,定,量,，,1U,酶的限制性内切酶活性指在一定时间内,(,60min,),适当温度下和建议使用的缓冲液中,在,50,l,反应体系中,将,1,g,底物,DNA,完全消化所需要的酶量,l,单位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物时,应根据情况确定所用酶量,l,根据本实验室的经验,1,g,底物,DNA,加入,5 U,的限制性,内切酶在,2h,时间内可以酶切完全，通常延长消化。,实验中可能出现的问题及其讨论,解决方法,1.,标准底物检测酶活性,2.,将,DNA,过柱纯化，乙醇沉淀,DNA,3.,检查反应系统是否最佳,4.,换用对,DNA,甲基化不敏感的同类酶酶解，重新将质粒,DNA,转化至,dcm-,dam-,基因型的细菌菌株,5.,换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化,DNA,，重新将质粒转至,dcm+,dam+,菌株中扩增,6.,将,DNA,底物与,DNA,混匀进行切割验证,7.,换用其它的酶切割,DNA,或过量酶消化进行验证,一,.,如果,DNA,完全没有被内切酶切割？,1.,内切酶失活,2.DNA,不纯，含有,SDS,，酚，,EDAT,等内切酶抑制因子,3.,条件不适（试剂、温度）,4.DNA,酶切位点上的碱基被甲基化,5.DNA,酶切位点没有甲基化,(,如,Dpn1),6.DNA,位点上存在其它修饰,7.DNA,不存在该酶识别顺序,解决方法,二,.,如果,DNA,切割不完全？,1.,内切酶活性下降,2.,内切酶稀释方法不正确,3.DNA,不纯，反应条件不佳,4.,内切酶识别的,DNA,位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰,5.,部分,DNA,溶液粘在管壁上,6.,内切酶溶液粘度大，取样不准,7.,酶切后,DNA,粘性末端退火,8.,由于反应溶液、温度使内切酶变性,9.,过度稀释使酶活性降低,10.,反应条件不适,11.,识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,1.,用,5-10,倍量过量消化,2.,用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶,3.,同上,4.,同上,5.,反应前离心数秒,6.,将内切酶稀释，增大取样体积,7.,电泳前将样品置,65,保温,5-10,分钟，取出后置冰浴骤冷,8.,使用标准反应缓冲液及温度,9.,适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏,10.,使用最佳反应体系,11.,加大酶量,5-10,倍,1.,用,DNA,作底物检查酶切结果,2.,电泳检查,DNA,，换用其它酶切，纯化,DNA,片段,三,.,如果,DNA,片段数目多于理论值？,1.,其它内切酶污染,2.,底物中含其它,DNA,杂质,解决方法,限制性核酸内切酶的,应用,用于,DNA,基因组,物理图谱,的组建,基因的定位和基因分离,DNA,分子碱基序列分析,比较相关的,DNA,分子和,遗传工程,将水稻叶绿体的,DNA,，用,EcoR1,限制性核酸内切酶,消化后，放入含有溴化乙锭的低熔点（,LMP,）的,1%,琼脂糖凝胶中做电泳分离。从,LMP,中分离出分子大小为,之间的,DNA,片段，再与同样经过,EcoR1,限制性核制性内切酶,切割并用碱性磷酸酶做了脱磷酸化处理的,pBR322,质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆菌,5346,菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成,Ampr,转化子菌落群体。这样就构成了由,EcoR,限制性核酸内切酶,切割的水稻,DNA,基因组库。用,Ampr,转化子菌落与,32P,放射性标记的,psbA DNA,探针做菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒,DNA,，经进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因,psbA,的序列。,应用一,应用二,利用,pBR322,作为载体,重组人体的抑生长激素,也是一个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有,lac,操纵子,起始部分的片段（包括启动子，操作区，核糖体集合位点和,-,半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。由于有了,lac,操作子,的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了,