DNA甲基化与临床应用ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/4/6,DNA甲基化与临床应用,#,DNA,甲基化与临床应用,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基化与临床应用DNA甲基化与临床应用,1,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,DNA甲基化与临床应用,目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关,2,为什么,熊猫,是,黑白,的？,基因决定命运,DNA甲基化与临床应用,为什么熊猫是黑白的？基因决定命运DNA甲基化与临床应用,3,同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但他们长大成人后在性格,、,健康方面往往存在很大差异。,DNA甲基化与临床应用,同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但,4,先从表观遗传学谈起,相同的基因型,不同的表型,?,基因,环境,表型,表观遗传学,DNA甲基化与临床应用,先从表观遗传学谈起相同的基因型 不同的表型?基因环境,5,现代表观遗传学,概念：,基因的,DNA,序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生,可遗传,的表型。,表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）：,DNA,甲基化,-,表观遗传学的核心（最初始的调控方式）,组蛋白修饰,MicroRNA,Genomic imprinting,DNA甲基化与临床应用,现代表观遗传学概念：DNA甲基化与临床应用,6,不同层次表达调控,DNA甲基化与临床应用,不同层次表达调控DNA甲基化与临床应用,7,DNA,甲基转移酶,：,DNMT,胞嘧啶：,Cytosine,5-,甲基胞嘧啶,：,5-Methylctosine,S-,腺苷,-,甲硫氨酸,：,SAM,S-,腺苷,-,高半胱氨酸,：,SAH,DNA,甲基化,是指在,DNA,甲基化转移酶,的作用下，在基因组,CpG,二核苷酸的,胞嘧啶,5,碳位以共价键结合一个,甲基,基团。,DNA,甲基化的概念,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基转移酶：DNMT DNA甲基化是指,8,DNA,甲基转移酶,(DNMT),哺乳动物体内有三种,DNA,甲基化转移酶：,DNMT1,、,DNMT3A,和,DNMT3B,。,DNMT1-,持续性,DNA,甲基转移酶；与甲基化相关，缺乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形。,DNMT3A,、,DNMT3B-,从头甲基转移酶；与去甲基化相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达。,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基转移酶(DNMT)哺乳动物体内有三种DNA甲基化转,9,通常启动子和第一个外显子区，,CpG,序列密度非常高，超过均值,5,倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区。,结构基因组中,70%,90%,的独立,CpG,都被甲基化,未甲基化的,CpG,成簇地聚集形成,CpG,岛,约有,60,以上基因的启动子含有,CpG,岛。,是结构基因启动子的核心序列和转录起始点。,CpG,岛（,CpG island,）,预测软件,DNA甲基化与临床应用,通常启动子和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5,10,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,DNA甲基化与临床应用,目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关,11,DNA,甲基化的生物学作用,在发育和分化中调控基因的表达,转录抑制,特征性表型基因的表达（肤色、毛发）,X,染色体的失活（,X-inactivation,）,基因印记,碱基突变,肿瘤代谢,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基化的生物学作用在发育和分化中调控基因的表达DNA甲,12,DNA,甲基化作为一种可遗传的表观遗传修饰，在体细胞增殖过程中通过依赖于,DNA,复制的,DNA,甲基转移酶,Dnmt1,稳定地传递给子细胞。但在胚胎发育的不同时期，基因组范围内的,DNA,甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发育阶段，甲基化模式在配子形成时已经建立。,DNA,甲基化与胚胎发育,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基化作为一种可遗传的表观遗传修饰，,13,DNA,甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中的重编程,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中的重编程DNA甲基,14,CPG island,的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达,基因表达的调控开关,转录抑制,DNA甲基化与临床应用,CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基,15,影响,基因表达,直接抑制基因表达或甲基化的,CpG,双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族 识别，而后者可通过吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰蛋白质来改变染色质的活性，以间接方式影响基因表达。,DNA甲基化与临床应用,影响基因表达 直接抑制基因表达或甲基化的 Cp,16,IAP:intracisternal A particle,去甲基化：灰鼠基因（,agouti,）仅微量表达,甲基化：基因超量表达,特征性表型基因的表达,DNA甲基化与临床应用,IAP:intracisternal A part,17,X,染色体的失活,X,染色体的失活（,X-inactivation,）：生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条,X,染色体其中一条失去活性的现象。,研究发现失活的染色体上,DNA,序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。,避免因拥有两条,X,染色体而产生双倍,基因产物，保持和雄性动物,X,染色体,数量及功能上的一致性。,DNA甲基化与临床应用,X染色体的失活X染色体的失活（X-inactivation,18,基因组印记？,组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达的现象，相应的基因则称为印记,基因。,父系不表达称父系印记,母系不表达称母系印记,基因印记,DNA甲基化与临床应用,基因组印记？组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性，即只有一,19,差异甲基化区域,差异甲基化区域,(differentially methylated region,，,DMR),，是指染色体上甲基化状态具有亲本特异性的区域，即来源于不同亲本的,DNA,序列甲基化状态不同的区域,差异甲基化主要发生在基因的启动子区，少数在外显子，现已发现的印记基因大多数具有,DMR,或受,DMR,调控。,DNA甲基化与临床应用,差异甲基化区域 差异甲基化区域(differentially,20,碱基,C T,突变,碱基突变,甲基化 突变,DNA甲基化与临床应用,碱基C T突变碱基突变,21,肿瘤细胞发生时常出现,DNA,甲基化模式的变化，主要包括甲基化转移酶表达水平的提高、基因组整体甲基化水平的降低和,CpG,岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组不稳定，如染色质构象异常、转座子激活、原癌基因激活表达以及抑癌基因被抑制表达等。,DNA,甲基化与肿瘤,DNA甲基化与临床应用,肿瘤细胞发生时常出现DNA甲基化模式的变化，,22,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,DNA甲基化与临床应用,目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关,23,A,基因组甲基化水平,(Methylation Content),的分析,高效液相色谱,高效毛细管电泳法,B,候选基因,(Candidate Gene),甲基化分析,甲基化敏感性限制性内切酶,-PCR/Southern,法,重亚硫酸盐测序法,甲基化特异性的,PCR,甲基化荧光法,(MethyLight),焦磷酸测序,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,甲基化检测相关技术,DNA甲基化与临床应用,A基因组甲基化水平(Methylation Content,24,C.,基因组范围的,DNA,甲基化模式与甲基化谱分析,限制性标记基因组扫描,甲基化间区位点扩增,甲基化,CpG,岛扩增,差异甲基化杂交,由连接子介导,PCR,出的,HpaII,小片断富集分析,甲基化,DNA,免疫沉淀法,DNA甲基化与临床应用,C.基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析 DNA甲基,25,高效液相色谱法,DNA甲基化与临床应用,高效液相色谱法DNA甲基化与临床应用,26,直接测序法,DNA甲基化与临床应用,直接测序法DNA甲基化与临床应用,27,焦磷酸测序法,通过检测,CpG,对应位点上,C/T,渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。,DNA甲基化与临床应用,焦磷酸测序法 通过检测CpG对应位点上C,28,全基因组甲基化图谱,全基因组甲基化测序（,WGBS,）,DNA甲基化与临床应用,全基因组甲基化图谱全基因组甲基化测序（WGBS）DNA甲基化,29,芯片平台,Illumina,850K,芯片可检测人全基因组约,853,307,个,CpG,位点的甲基化状态。,850K,芯片不但保持了对,CpG,岛，基因启动子区的全面覆盖，还特别加强了增强子区以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组,DNA,甲基化芯片。,Illumina,850K,芯片技术,流程,DNA甲基化与临床应用,芯片平台 Illumina 850K芯片可检测,30,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基化与临床应用,31,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,DNA甲基化与临床应用,目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关,32,正常生物,DNA,甲基化,DNA,甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组,DNA,经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种,DNA,甲基化模式就相对稳定下来。,DNA甲基化与临床应用,正常生物DNA甲基化DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞,33,肿瘤组织的,DNA,甲基化,肿瘤中普遍存在,DNA,甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。,肿瘤细胞的特征：,癌基因 低甲基化 被激活,抑癌基因 高甲基化 被沉默,DNA甲基化与临床应用,肿瘤组织的DNA甲基化肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，,34,DNA甲基化与临床应用,DNA甲基化与临床应用,35,应用前景,1-,肿瘤的早期,诊断,抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达,优点：,DNA,甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本）,缺点：特异性不足,DNA甲基化与临床应用,应用前景1-肿瘤的早期诊断抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早,36,表观遗传学生物标记开发,2017,年,3,月，张鹍教授团队在,Nature Genetics,（,NG,）杂志发布了令人振奋的研究成果，利用更灵敏的算法配合组织甲基化模式开发的无创诊断技术，可以检测并定位肿瘤。通过比较肿瘤和正常细胞的,DNA,甲基化数据找到肿瘤特异的甲基化,Marker,。,DNA甲基化与临床应用,表观遗传学生物标记开发 2017年3月，张鹍,37,燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统,(MERMAID),，运用多层级甲基化探针设计策略，可实现在检测成本可控的情况下同时检测,超过,10,万个临床诊断相关的甲基化,CpG,位点,，并通过机器学习算法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。,cfDNA,无创甲基化检测系统,(MERMAID),用于肺部占位病变（含肺癌）的早筛可实现,99.6%,的敏感性和,100%,的特异性，用于肺部结节良恶性判定可实,84.8%,的敏感性和,87.5%,的特异性。,cfDNA,甲基化液体活检技术,DNA甲基化与临床应用,燃石医学自主研发了无创甲基化检