微生物的菌种选育

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5.,微生物菌种选育,微生物的菌种选育,第1页,理想发酵工业用菌要求,1,、遗传性状稳定；,2,、生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；,3,、目标产物产量尽可能靠近理想转化率；,4,、最好是胞外产物；,5,、尽可能降低产物类似物生成；,6,、培养基简单、起源广、价格低；,7,、对,T,、,pH,、离子强度、剪切力不敏感；,8,、溶氧要求低、便于培养能耗低；,微生物的菌种选育,第2页,5.1,从自然界中取得新菌种,5.1.1,采样,5.1.2,增殖,5.1.3,纯化,5.1.4,性能判定,调查研究，查阅资料,设计试验方案,确定样品生态环境、季节选择和地点选择,采样,增殖培养,(1),控制营养成份,(2),控制,pH,(3),温度控制,微生物的菌种选育,第3页,纯种分离,(1),稀释法,(2),划线法,(3),组织分离,原种斜面,筛选,(1),纸片培养显色法,(2),透明圈法,(3),变色圈法,(4),生长圈法,(5),抑菌圈法,复筛,再复筛,3,5,株,性能判定,发酵,pH,、,T,、通风、搅拌、无菌程度、适应性、副产品和对低劣廉价原料利用,毒性试验,菌种判定,微生物的菌种选育,第4页,5.2,基因突变和微生物菌种选育,微生物的菌种选育,第5页,一、3个经典试验,（一）,经典转化试验,最早进行,转化,（,transformation,）,试验是,F.Griffith（1928,年）,，他以,Streptococcus pneumoniae,（,肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。,5.2.1,遗传变异物质基础,微生物的菌种选育,第6页,（1）,动物试验,著名肺炎球菌转化试验,S,型，致病菌，,具荚膜，菌落表面光滑（,smoth）,R,型，非致病菌，,无荚膜，菌落表面粗糙（,rough）,S,型,R,型,加热灭菌,热死,S,菌活,R,菌,微生物的菌种选育,第7页,微生物的菌种选育,第8页,（2）,细菌培养试验,微生物的菌种选育,第9页,（3）,S,型菌无细胞抽提液试验,微生物的菌种选育,第10页,Avery,在四十年代以更精密试验设计重复了以上试验,微生物的菌种选育,第11页,（1）从活,S,菌中抽提各种细胞成份（,DNA，,蛋白质，荚膜多糖等）,（2）对各组分进行转化试验,微生物的菌种选育,第12页,只有,DNA,被酶降解破坏抽提物无转化活性,DNA,是转化所必需转化因子,微生物的菌种选育,第13页,（二）,噬菌体感染试验,1952年，,A.D.Hershey,和,M.Chase,发表了证实,DNA,是噬菌体遗传物质基础著名试验,噬菌体感染试验,微生物的菌种选育,第14页,35,S,蛋白质外壳噬菌体,32,PDNA,关键噬菌体,微生物的菌种选育,第15页,在,DNA,中存在着包含合成蛋白质外壳在内整套遗传信息。,微生物的菌种选育,第16页,（三）,植物病毒重建试验,为了证实核酸是遗传物质，,H.Fraenkel-Conrat,（1956）,用含,RNA,烟草花叶病毒,（,TMV）,进行了著名,植物病毒重建试验,。,微生物的菌种选育,第17页,烟草花叶病毒核酸,抗血清处理，证实杂种病毒蛋白质外壳来自,病毒1,，而非,病毒2,杂种病毒后代蛋白质外壳表现为,病毒2,，而非,病毒1,遗传物质是核酸（,RNA）,而非蛋白质,霍氏车前病毒,蛋白质外壳,HRV,HMV,微生物的菌种选育,第18页,亚病毒一个：含有传染性蛋白质致病因子，迄今为止尚为发觉该蛋白内含有核酸。,其致病作用是因为动物体内正常蛋白质,PrP,c,改变折叠状态为,PrP,sc,所致，而这二种蛋白质一级结构并没有改变。,二、朊病发觉与思索,微生物的菌种选育,第19页,思索,1）蛋白质是否能够作为遗传物质？,prion,是生命一个特例？还是仅仅为表示调控一个形式？,2）蛋白质折叠与功效关系，是否存在折叠密码？,DNA,RNA,肽链蛋白质,微生物的菌种选育,第20页,三、原核微生物质粒,1.定义和特点,质粒：,一个独立于染色体外，能进行自主复制细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,微生物的菌种选育,第21页,cccDNA,ocDNA,lDNA,微生物的菌种选育,第22页,另一类质粒复制与核染色体复制不一样时，,在这类细胞中，普通含1015个或更多质粒。,严紧型复制控制,（,stringent replication control,）,松弛型复制控制,（,relaxed replication control,）,质粒复制与核染色体复制同时，,在这类细胞中，普通只含12个质粒；,质粒是一个独立存在于细胞内,复制子,（,replicon,）,。,微生物的菌种选育,第23页,通常以共价闭合环状（,covalently closed circle，,简称,CCC）,超螺旋双链,DNA,分子存在于细胞中；,也发觉有线型双链,DNA,质粒和,RNA,质粒；,质粒分子大小范围从1,kb,左右到1000,kb；,（细菌质粒多在10,kb,以内）,2.质粒分子结构,微生物的菌种选育,第24页,提取全部胞内,DNA,后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于试验室惯用菌，可用质粒所带一些特点，,如抗药性初步判断。,特定质粒提取方法和后处理使染色体和,RNA,均被除掉。,3.质粒检测,微生物的菌种选育,第25页,质粒主要功效,在一些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊机能，,从而使宿主得到生长优势。,质粒所含基因对宿主细胞普通是非必需；,微生物的菌种选育,第26页,质粒所编码,功效和赋,予宿主表,型效应,致育因子,（,Fertility factor，F,因子）,抗性因子,（,Resistance factor，R,因子）,产细菌素质粒,（,Bacteriocin production plasmid）,毒性质粒,（,virulence plasmid）,代谢质粒,（,Metabolic plasmid）,隐秘质粒,（,cryptic plasmid）,4.质粒主要类型,微生物的菌种选育,第27页,（,1,）,F,质粒（,F plasmid）,又称,F,因子、致育因子（,fertility factor,）或性因子（,sex factor），,其大小约100,kb，,为,cccDNA，,这是最早发觉一个与大肠杆菌有性生殖现象（接合作用）相关质粒。,微生物的菌种选育,第28页,携带,F,质粒菌株称为,F,+,菌株（相当于雄性），,无,F,质粒菌株称为,F,-,菌株（相当于雌性）。,微生物的菌种选育,第29页,（,2,）,R,质粒（,R plasmid）,包含抗药性和抗重金属二大类。,又称,R,因子,（,R factor）,、,抗性因子,（,resisitrance plasmid,）,。,微生物的菌种选育,第30页,含调整,DNA,复制和拷贝数基因以及转移基因，相对分子量约11,10,7,，,含有转移功效；,抗性转移因子,（,resistance transfer factor，RTF）,抗性决定因子,（,r-determinant）,大小不很固定，相对分子量从几百万至11,10,8,以上，无转移功效，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,R,质粒普通由两个相连,DNA,片段组成,微生物的菌种选育,第31页,由,RTF,和,r,决定子结合而形成,R,质粒过程：,抗性质粒在细菌间传递是细菌产生抗药性主要原因之一。,微生物的菌种选育,第32页,R100,质粒（89,kb）,可使宿主对以下药品及重金属含有抗性：,汞（,mercuric ion，mer）,四环素（,tetracycline，tet）,链霉素（,Streptomycin,Str）、,磺胺（,Sulfonamide,Su）、,氯霉素（,Chlorampenicol,Cm）,夫西地酸（,fusidic acid，fus）,而且负责这些抗性基因是成簇地存在于抗性质粒上。,R,质粒种类很多，,比如，,R1（94kb）,和,R100（89.3kb）,等。,微生物的菌种选育,第33页,（,3,）,Col,质粒（,colicin plasmid，col plasmid）,又称,大肠杆菌素质粒,或,产大肠杆菌素因子,（,colicinogenic factor，col factor）,。,细菌素,（,bacteriocin）,是质粒编码蛋白质，普通由细菌产生，可抑制或杀死其它近缘细菌或同种不一样菌株代谢产物，但不含有很广杀菌谱。,微生物的菌种选育,第34页,细菌素结构基因、,包括细菌素运输及发挥作用（,processing）,蛋白质基因、,赋予宿主对该细菌素含有“免疫力”相关产物基因,普通都位于质粒或转座子上，,细菌素能够杀死同种但不携带该质粒菌株。,微生物的菌种选育,第35页,细菌素普通依据产生菌种类进行命名：,大肠杆菌（,E.coli,）,产生细菌素为,colicins（,大肠杆菌素），,而质粒被称为,Col,质粒。,Col E1,质粒：,相对分子量小（9,kb，,约5,10,6,），,无接合作用，是松弛性控制、多拷贝；,Colb,质粒：,相对分子量大（94,kb，,约8,10,7,），,含有经过接合而转移功效，属严紧型控制，只有12个拷贝。,微生物的菌种选育,第36页,（4）,Ti,质粒（,tumor inducing plasmid）,即,诱癌质粒,或,冠瘿质粒,（,crown gall plasmid）,。Ti,质粒是一个,200,kb,环状质粒，包含,毒性区（,vir,）,、,接合转移（,con,）,、,复制起始区（,ori,）,和,T-DNA,区,4部分。,T-DNA,区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，,Ti,质粒是植物基因工程中使用最广、效果最正确克隆载体。,微生物的菌种选育,第37页,Agrobacterium tumefaciens,（,根癌土壤杆菌或根癌农杆菌）释放出,Ti,质粒上,T-DNA,片断与植物细胞核基因组整合，合成冠瘿碱类（,opines,）,破坏控制细胞分裂激素调整系统，使之变成癌细胞。,微生物的菌种选育,第38页,（5）,Ri,质粒（,root inducing plasmid）,250,kb,Ri,质粒中一段,T-DNA,整合到,宿主根部细胞,核基因组中，可发生转化。,Agrobacterium rhizogenes,（,发根土壤杆菌或发根农杆菌）可侵染双子叶植物根部，并诱发大量称为毛状根不定根。,Ri,质粒是外源基因良好载体！,微生物的菌种选育,第39页,（6）,mega,质粒（,megaplasmid）,即,巨大质粒,，其相对分子量,比普通质粒大几十倍至几百倍，存在于,Rhizobium,（,根瘤菌属）中，,其上有一系列与共生固氮相关基因。,微生物的菌种选育,第40页,（7）降解质粒,这类质粒是由降解一系列复杂有机物酶编码，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。,只在假单胞菌属（,Pseudomonas,）,中发觉降解质粒。,微生物的菌种选育,第41页,降解质粒以其所分解底物命名，,比如，,CAM,（,樟脑）质粒，,OCT,（,辛烷）质粒，,XYL,（,二甲苯）质粒，,SAL,（,水杨酸）质粒，,MDL,（,扁桃酸）质粒，,NAP,（,萘）质粒，,TOL,（,甲苯）质粒等,微生物的菌种选育,第42页,“,超级菌”,经过遗传工程伎俩构建含有数种降解质粒菌株，含有广谱降解能力工程菌。,微生物的菌种选育,第43页,