微生物的实验培养

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一、课题目标：,掌握,培养基的制备,、,高压蒸气灭菌,和,平板划线法,等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,三、技能目标：,特点：,结构都相当简单,个体多数十分微小,.,通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构,.,且体内一般不含有叶绿素,.,不能进行光合作用,.,一、微生物基础知识,微生物,植物界,动物界,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,霉菌,酵母菌,食用菌,细菌,蓝藻,放线菌,支原体,衣原体,列克次体,生物,1,、微生物,2,、菌落,单个或少数细菌在固体培养基上,大量繁殖,时，就会形成一个肉眼可见的，具有,一定形态结构,的子,细胞群体,，叫做,菌落,。,菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,二、培养基,培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,。,不同的微生物所使用的培养基成分是不尽相同的。,1.,培养基含义,2.,培养基的成分,水分：,无机盐：,碳源：,有机碳（糖等）无机碳（,CO,2,、,CO,3,2-,等）,提供,C,元素，有机碳也能提供能量,氮源：,有机氮（蛋白质等）无机氮（,N,2,、,NO,2,-,、,NO,3,-,、,NH,4,+,等）,有机氮（蛋白质等）无机氮（,N,2,、,NO,2,-,、,NO,3,-,、,NH,4,+,等）,提供,N,元素，有机氮还能提供,C,元素、且能提供能量,生长因子：,微生物生长所必须的，自身又不能合成的有机小分子物质。,氨基酸、核苷酸、维生素、碱基等。,（1）按物理状态来分：培养基可分为,固体培养基,和,液体培养基,。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。,（2）按功能来分：可分为,选择培养基,和,鉴别培养基,。,（3）按成分来分：可分为,天然培养基,和,合成培养基,。,3.,培养基的种类,液体培养基：,主要用于工业生产,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,半固体培养基：,观察微生物的运动,无运动 有运动,(,弥散,),固体培养基：,主要用于微生物分离、鉴定、计数和保藏,常见的选择培养基,加入青霉素的培养基,:,分离酵母菌、霉菌等真菌,加入高浓度食盐的培养基,:,分离金黄色葡萄球菌,不加氮源的无氮培养基,:,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,:,分离自养型微生物,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。,合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。,优点：,标准化生产，组分和含量相对固定,;,成本低,缺点：,缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基,:,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,优点：,营养成分丰富，培养效果好,缺点：,来源受限,;,成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析,;,易发生支原体污染,;,天然培养基：,三、无菌技术,1.,无菌技术的概念,无菌操作泛指,在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,无论是,倒平板,、,平板划线,操作，还是,稀释涂布平板法,，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。主要包括以下几个方面：（教材,P15,）,只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,利用较温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）的过程。,2.,消毒与灭菌的概念及两者的区别,(2),灭菌的定义,用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌的过程。,(1),消毒的定义,灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,1),煮沸消毒法,:,100,煮沸,5-6min,2),巴氏消毒法：,70-75,下煮,30min,或,80,下煮,15min,3),化学药剂消毒法,:,用,75%,酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒,;,氯气消毒水源,4),紫外线消毒,(1),消毒的方法：,3.,常用的消毒与灭菌的方法,1),灼烧灭菌,2),干热灭菌：,160-170,下加热,1-2h,。,3),高压蒸气灭菌：,100kPa,、,121,下维持,15-30min,.,(2),灭菌的方法：,1.,无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。,（,1,）培养细菌用的培养基与培养皿,（,2,）玻棒、试管、烧瓶和吸管,（,3,）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（,1,）（,2,）需要灭菌；（,3,）需要消毒,。,旁栏思考,3.,微生物实验室培养的基本操作程序,1,、器具的灭菌,2,、培养基的配制,3,、培养基的灭菌,4,、倒平板,5,、微生物接种,6,、恒温箱中培养,7,、菌种的保存,1,、培养基配制,（,1,）原则,1,）目的明确：要根据微生物和种类、培养目的等选择原料，配制培养基。,2,）营养要协调：各种营养物质要保证适当的浓度和比例。,3,）,PH,值要适当：不同微生物生长所需,PH,值不同。,四、实验操作,（,2,）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,（,3,）配制过程,）计算,）称量,）溶化,）灭菌,）倒平板,倒平板技术,1.,培养基灭菌后，需要冷却到,50,左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.,为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基表面的水分挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,2、纯化大肠杆菌：,微生物的接种技术,接种方法有：,平板划线法,:,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面,.,在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落,.,平板划线法和稀释涂布平板法,问题讨论,1.,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线,？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,:,将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。,在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第,2,步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,菌种的保存,1,、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于,4,冰箱保存。,2,、长期保存：甘油冷冻管藏法,【,典例解析,】,例,1,关微生物营养物质的叙述中，正确的是,A.,是碳源的物质不可能同时是氮源,B.,凡碳源都提供能量,C.,除水以外的无机物只提供无机盐,D.,无机氮源也能提供能量,答案：,D,例,2,下面对发酵工程中灭菌的理解,不正确,的是,A.,防止杂菌污染,B.,消灭杂菌,C.,培养基和发酵设备都必须灭菌,D.,灭菌必须在接种前,答案：,B,编号,成分,含量,粉状硫,10g,(,NH,4,),2,SO,4,0.4g,K,2,HPO,4,4.0g,MgSO,4,9.25g,FeSO,4,0.5g,CaCl,2,0.5g,H,2,O,100ml,例,3,右表是某微生物培养基成分，请据此回答：,（,1,）右表培养基可培养的微生物类型,是,（,2,）若不慎将过量,NaCl,加入培养基中。,如不想浪费此培养基，可再加入,.,自养型微生物,含碳有机物,（,3,）若除去成分，加入（,CH2O,），该培养基可用于培养,。,（,4,）表中营养成分共有,类。,（,5,）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是,。,（,6,）右表中各成分重量确定的原则是,。,（,7,）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是,。,固氮微生物,3,调整,pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,