石蜡切片技术--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,PPT课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,PPT课件,*,第二章 石蜡切片技术,1,PPT课件,第二章 石蜡切片技术1PPT课件,一、显微切片技术产生的原因,光学显微镜发展到一定程度之后，渴望知道细胞结构,由于组织太厚，光线很难穿过,压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，看不到其他结构，因此需要切片变薄。,因细胞水多，太软，无法切片,鉴于上述情况找到一种方法使,细胞水,被替代，变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是石蜡切片技术,2,PPT课件,一、显微切片技术产生的原因光学显微镜发展到一定程度之后，渴,二、石蜡切片技术的优点,为什么选择这一技术呢？主要因为它有以下优点：便于推广、经济、适用、简便。,经济,价格低，可反复使用；,技术难度不大，容易掌握，,但要精通也不容易；,设备要求不高；,可长期保存；,染色容易，而且都能被染色，形成好的反差和好的选择性。,3,PPT课件,二、石蜡切片技术的优点 为什么选择这一技术呢？主,三、石蜡切片的主要过程,杀生（取材）,固定,冲洗,脱水,保存,透明,石蜡透入,包埋,切片,复水,染色,脱水,封藏,观察保存,（一）取材、固定、洗涤、脱水,（二）透明、透蜡、包埋,（三）切片、贴片,（四）染色、封藏,4,PPT课件,三、石蜡切片的主要过程 杀生（取材）固定,（一）取材,杀生（动物）,1.,目的：,动物必须杀生，然后取出所需组织,2.,方法：,一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，取出所需组织。,3.,注意事项：,性别合适,麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动，进而影响细胞结构,取材部位要准，,速度快,5,PPT课件,（一）取材杀生（动物）5PPT课件,（一）取材,1.,目的,：得到所需要的组织,2.,方法：,a.,用剪刀剪下组织,b.,冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶液）植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤损伤，用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。,c.,切成小块,3,注意事项：,要准,要快,避免损伤（方向，刀要快，不能挤压）,植物取材：,用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构，同时发育程度、部位要准。,6,PPT课件,（一）取材 1.目的：得到所需要的组织6PPT课件,（二）固定,1.,目的：,为了使取样的细胞在形态结构和成分方面保持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞避免失水变形，自溶破坏结构等。,固定液的选择：,快；不溶解；不收缩膨胀；软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期保存等,7,项。,7,PPT课件,（二）固定 1.目的：7PPT课件,2.,方法,（,1,）固定剂的种类：,一般采用化学固定,单纯固定：,只用一种试剂固定：,混合固定：,用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如：,8,PPT课件,2.方法8PPT课件,单纯固定：,福尔马林,formalin:10%,的甲醛（,37%,40%,）,醋酸（,0.3%5%,）,苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚）,铬酸,0.51%,锇酸,12%,升汞（氯化汞饱和水溶液约,7%,）,9,PPT课件,单纯固定：9PPT课件,混合固定：,用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如：,卡诺氏固定液,酒精：冰醋酸（,3,：,1,）,酒精：冰醋酸：氯仿（,6,：,1,：,3,）适用于动植物一般组织细胞。,FAA,福尔马林,(38%,甲醛,)5 ml:,冰醋酸,5ml:70%,酒精,90 ml,幼嫩材料用,50%,酒精代替,70%,酒精,可防止材料收缩,;,还可加入,5 ml,甘油,(,丙三醇,),以防蒸发和材料变硬,.,但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究,10,PPT课件,混合固定：用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如：10P,卡诺氏固定液,(Carnoys Fluid),适用于一般植物组织和细胞的固定,常用于根尖,花药压片及子房石蜡切片等,.,有极快的渗透力,根尖材料固定,15,20min,即可,花药则需,1h,左右,此液固定最多不超过,24h,固定后用,95%,酒精冲洗至不含冰醋酸为止,;,如果材料不马上用,需转入,70%,酒精中保存,.,固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。,11,PPT课件,卡诺氏固定液(Carnoys Fluid)适用于一般植物,F.A.A,固定液,又称标准固定液,万能固定液,.,适用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片,.,在植物形态解剖研究上应用极广,;,FAA,固定液的优点在于：,兼有保存剂作用,冰醋酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又是细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免疫组化无碍更无掉片之理。,FAA,固定液具有强大的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！,对染色体的观察效果较差,.,12,PPT课件,F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适用于一般根,（,2,）固定方法,静置固定：,将组织块放入盛有固定液的小的称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低温（,04,）固定一段时间，不断摇动能增加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。,灌注固定：,常用于动物，将固定液通过已麻醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现象，但较繁琐。,13,PPT课件,（2）固定方法静置固定：将组织块放入盛有固定液的小的称量瓶,3.,固定时应注意的事项,固定条件的选择：,种类、浓度、温度和时间,固定要快否则会自溶：,组织快，不能太多，否则固定不透：,14,PPT课件,3.固定时应注意的事项固定条件的选择：种类、浓度、温度和时间,（三）冲洗,1.,冲洗的目的,除去固定剂，主要是防止固定的毒害作用，固定时间太长，组织收缩变脆。,15,PPT课件,（三）冲洗 1.冲洗的目的15PPT课件,2.,冲洗的方法,冲洗液随固定液而定，冲洗的选择：,不形变提取，不反应，有效除去固定液。,固定液为水溶液时，以水或低浓度的酒精冲洗；,固定液是酒精多以不同浓度的酒精冲洗，以酒精冲洗，浓度要低于固定液的酒精浓度。材料与酒精的比例一般为,1,：,10,（加入的体积）（,70%,乙醇换洗,3,次，每次,2060min,）,16,PPT课件,2.冲洗的方法 冲洗液随固定液而定，冲洗的选择：不形变,（,2,）冲洗方法,静置冲洗：,加入冲洗液，静置一段时间，倒出该液，加入新的冲洗液，反复几次（,56,次），每次,30,分钟左右，振荡有好处。（时间开始一次为,2030,分钟，以后几次可延长,12h,，）具体时间与材料性质、大小和温度有关。,流水冲洗：,将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流水冲洗，效果较静置冲洗为好，时间为,1224h,，但流水不能太大太急，也不能太长，太长使组织变软肿胀，冲洗时间有时长达,24h,左右，如木本植物的木质部。,17,PPT课件,（2）冲洗方法静置冲洗：加入冲洗液，静置一段时间，倒出该液,3.,注意事项,(1),冲洗彻底,否则收缩、变硬、抽取,(2),不能时间太长太急,变软，肿胀（吸水）,(3),摇动有利于冲洗干净,加快分子运动,18,PPT课件,3.注意事项 (1)冲洗彻底否则收缩、变硬、抽取1,（四）脱水,1.,目的：,因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细胞中的水彻底脱掉，否则石蜡进不去材料，无法让细胞变硬，无法进行切片。,19,PPT课件,（四）脱水1.目的：19PPT课件,2.,方法,脱水剂的选择,原则：,凡与水和石蜡亲和性好的,且不使细胞剧烈收缩膨胀，,不能大量抽提细胞成分均可作为脱水剂。常用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外还有叔丁醇、正丁醇等。,脱水的一般过程：,多采用静止脱水,15%,35%,50%,70%,83%,95%,100%,（,23,次），丙酮较酒精快，浓度相应低一些。起始浓度的选择主要根据材料的性质而定，动物和幼嫩植物一半从,15%,或,35%,开始；老的或木质成分多从,15%,或,70%,开始。如木本植物的茎。,脱水时间：,每次脱水时间也是根据细胞的老嫩即含水量和组织块大小及温度而定，原则是嫩短老长，嫩的,15-30m,，老的,30m-4h,，还可长达,8-12h,，如洋葱一般为,1h,脱水的温度：,室温和,0-4C,两种，前者时间短，后者缓慢一些。,20,PPT课件,2.方法脱水剂的选择20PPT课件,3.,注意事项：,脱水一定要脱干净，彻底，,否则石蜡很难进入而导致不能切片。,脱水时间长短要合适，,太短脱不干净，太长低浓度容易细胞变软，膨胀；太长高浓度则细胞收缩，变脆，提取严重，影响切片。,梯度不能太大，,负责拉伤，最后,100%,乙醇脱水要,2-3,次，以保证脱水完全。,保存，只能在,70%,酒精中保存（,04,）,若时间不够可暂时保存在,70%,酒精中过夜，第二天再继续实验。也可长期保存几个月，在,1,：,1,：,1=,甘油：蒸馏水：,95%,酒精中保存最好（低温）,21,PPT课件,3.注意事项：脱水一定要脱干净，彻底，否则石蜡很难进入而导致,（五）透明,1.,目的：,为了使石蜡更好进入组织，解决乙醇与石蜡亲和性较差的问题，并能增加遮光系数，且与封藏剂很好混合；,22,PPT课件,（五）透明1.目的：22PPT课件,2.,方法：,（,1,）透明剂的种类,a.,选择的原则：,与乙醇和石蜡均有较好的亲和性，,又不破坏细胞结构（形态、结构）,不能大量提取细胞成分,b.,种类：二甲苯、氯仿、香柏油，苯胺油，其中以二甲苯最好,（,2,）透明过程,（乙醇：二甲苯）,2:1,1:1,1:2,纯（二甲苯）但有时也只用,1,：,1,和纯的二甲苯即可，时间要长（,1h,）纯的二甲苯要多换几次保证去乙醇完全。,（,3,）时间：随,组织块大而异，也与温度有关。一般为,30m2h,，如洋葱根尖为每次,1h,（,4,）温度：,多常温。,23,PPT课件,2.方法：（1）透明剂的种类23PPT课件,3.,注意事项,（,1,）透明要完全彻底除去乙醇或丙酮,（,2,）时间过长会使组织变硬变脆，出现收缩，过短，透明不彻底，乙醇除不尽，石蜡进入不好，会出现空洞。,（,3,）换二甲苯是要快，因二甲苯易挥发使浓度改变,（,4,）盖严防止水分和空气（,CO,2,）进入，出现混浊和酸度变化因而受酸影响。,24,PPT课件,3.注意事项（1）透明要完全彻底除去乙醇或丙酮24PPT课,（六）石蜡透入,1.,目的：,让石蜡透入细胞，代替二甲苯支持细胞，增加强度，防止在切片时细胞变形和破碎，便于切片。,25,PPT课件,（六）石蜡透入1.目的：25PPT课件,2.,透蜡,（,1,）对石蜡的要求,（,2,）透蜡的过程,26,PPT课件,2.透蜡（1）对石蜡的要求26PPT课件,（,1,）对石蜡的要求,熔点已知,质量：结构细腻，,光滑均匀,无灰尘和挥发物；,a,透明：,b,无不透明的物；,c,无气泡,种类：,石蜡熔点在,4260,之间，包埋石蜡在,5060,之间，可分为两种,软石蜡,5256,（动物）,硬石蜡,5458,（植物）,浸片（,4um,以下）用,5660,为好。,27,PPT课件,（1）对石蜡的要求熔点已知27PPT课件,石蜡好坏可用以下方法辨别：,a.,熔入纸盒中无气泡（挥发物；）,b.,无不透明颗粒（灰尘），断裂处无颗粒（灰尘，切片无细小颗粒（灰尘）,C.,在,30-35,放置,24,小时无气泡或不透明结晶状小点。,不好石蜡的利用,：,加热至开始冒烟后移至火焰较小的的灯上，再加热数小时，除去挥发物和水分；,冷却后杂质下沉可除去，所以使用过的石蜡可再重复利用切效果较好。,28,PPT课件,石蜡好坏可用以下方法辨别：28PPT课件,透蜡的过程,植物：,二甲苯,:,石蜡,纯石蜡,50ml,烧杯,2,个,1/2,二甲苯,1/2,石蜡,石蜡,石蜡，根据组织块的大小，每步,20min60min,，温度,6