DNA合成原理

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,寡 聚 核 苷 酸,背景介绍,寡核苷酸的化学结构,寡核苷酸的用途,寡核苷酸的化学合成原理,寡核苷酸的纯化方法,DNA,的化学结构,双连螺旋结构,1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径,核 酸,A,（腺嘌呤）、,G,（鸟嘌呤）、,C,（胞嘧啶）、,U,（尿嘧啶）、,T,（胸腺嘧啶）,核苷酸,脱氧核苷酸,核 苷,磷 酸,戊糖：,核糖,碱基：,A,、,G,、,C,、,U,脱氧核 苷,磷 酸,戊糖：,脱氧核糖,碱基：,A,、,G,、,C,、,T,Base=A,G,C,T,Base=A,G,C,U,脱氧核苷酸,核苷酸,T,胸腺嘧啶,Thymine,A,腺嘌呤,Adenine,G,鸟嘌呤,Guanine,U,尿嘧啶,Uracil,C,胞嘧啶,Cytosine,G,鸟嘌呤,C,胞嘧啶,T,胸腺嘧啶,A,腺嘌呤,寡聚核酸的用途,PCR,扩增,DNA,测序,亚克隆，点突变,基因建构（全基因合成）,反义核酸,多聚酶链式反应,PCR,：,Polymerase Chain Reaction,PCR,是由美国科学家穆利斯,(Kary Mullis),提出的一种体外简化条件下模拟,DNA,体内复制的,DNA,快速扩增的方法，此技术获得,1993,年诺贝尔化学奖。,PCR,的基本工作原理就是以拟扩增的,DNA,分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在,DNA,聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的,DNA,合成。,基本反应步骤：,高温变性,低温退火,适温延伸,。,寡核苷酸的化学合成原理,目前，,oligo DNA,的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法是将,DNA,固定在固相载体上，经过四步循环反应：,脱保护、耦连、加帽、氧化,，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去，最终完成,DNA,链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较稳定的优点。,该方法的特点：,第一个核苷酸是,3,固定在固相载体上,每一个核苷酸依次连接上去,DNA,合成的方向是,3,5,合成是在疏水环境中进行,dA-phosphoramidite,dT-phosphoramidite,dG-phosphoramidite,dC-phosphoramidite,1.,脱,DMT,（,Detritylation,）,CPG,：,Controlled pore glass,，可控微孔玻璃珠，作为寡居核苷酸依附的,固体载体。,2.,耦连（,Coupling,）,活化（,Activation,）,b.,耦连（,Coupling,）,3.,加帽（,Capping,）,耦连中未反应核苷酸链,已加帽核苷酸链,4.,氧化（,oxidation,）,核苷酸的纯化方法,在所有合成循环结束后，就得到一个目标,DNA,片段粗品，首先需经过,氨解,步骤，然后再通过各种方式进行纯化。,氨 解,切 割：将合成好的寡聚核苷酸从固体载体（,CPG,）上化学切割下来。,常用新鲜的浓氨水来裂解,CPG,上连接化合物与初始核苷间的,酯键。,脱保护基：将合成好的寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉。,一般用新鲜的浓氨水来处理较长时间以脱掉氰乙基（,P,）、苯,甲酰基（,dA,、,dC,）、异丁酰基,（,dG,）。,纯 化,C18,柱脱盐纯化,OPC,纯化,PAGE,纯化,HPLC,纯化,C18,柱脱盐纯化,C18,柱上一种活性炭柱子，又称为简易反相柱，它对,DNA,有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，,所以能有效地去除盐分。,优点：所有纯化方法中最简单的一种。,缺点：不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成,效果很好时才能选用此法。,OPC,纯化,利用,OPC,柱中装有对,DMT,基团具有特殊亲和力的树脂，,合成,DNA,片段时保留,5,端最后一个碱基上的,DMT,，所有合,成产物吸附在,OPC,柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有,DMT,片段的吸附能力强，不易被洗脱，不带有,DMT,的片,段吸附能力弱从而被洗脱，然后用酸脱去吸附在,OPC,柱上,DNA,的,DMT,，再用浓一点的有机溶剂洗脱,DNA,。,优点：方便、快捷。,缺点：其专一性吸附,DMT,能力有限，不免仍然有短片段带,入的可能，而且负载量小，特别是对长于,25,个碱基,以上的片段纯化效果不好。,PAGE,纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳法，利用不同长度片段,DNA,在凝胶,中迁移率不同来分离大小片段。由于各分子所带电荷和,大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁,移速度慢，待目的片段与缺碱基片段分开后，经过剥离,凝胶，切割目的片段，浸泡碎胶，再从泡胶的盐溶液中,回收目的,DNA,。,优点：纯化效果好，尤其是纯化长链效果好。,缺点：费时费力，样品损失大。,HPLC,纯化,HPLC,根据吸附介质分为反相柱和离子柱。,反相柱是根据疏水性的差别来分离的，即疏水性更,强的长片段比短片段吸附能力更强，后出峰；,离子柱上根据不同长度寡核苷酸带有不同净电荷，,较长的片段带有高电荷比带有电荷低的短片段在离子柱,内流动得慢，从而依次将不同片段洗脱出来。,优点：自动化程度高，省人力，纯化效果好，纯度可达,99%,以上，特别是在标记引物和特殊修饰探针纯,化中效果好。,缺点：纯化量小，不能纯化长片段，设备昂贵。,各纯化方法的比较,纯化方法,优,点,和,缺,点,C18,柱脱盐,省时省力，但只能去除盐分，不能去除比目的片段短的小片段。,OPC,省时省力，纯化效果略好于,C18,柱，但对于小片段的去除效果不太好，并且吸附量低，对于长于,25bp,的片段纯化效果不好。,PAGE,纯化效果较好，能去除小片段，与,C18,柱联用效果更好，缺点是费时费力，样品损失大。,HPLC,自动化程度高、省人力，可以去除小片段，纯化效果较好，缺点是设备昂贵，纯化量小，通常不能纯化,40bp,以上的片段。,谢 谢,