第14章色谱技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1.色谱技术,概述,1.1概念：,色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,1.2特点：,（1）,纯化倍数高,（2）操作规模小，放大困难,（3）终产品纯化,（4）适用于价格昂贵的产品,傻涨仿杭瓤呐掉抒眯利瞄昏岩炳旋荚赂胶混哮护困轻樊椿枯展舔瞻七蓟幂第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,1,1.色谱技术概述1.1概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称,1.3色谱的分类,1.根据溶质分子与固定相相互作用的,机理不同,的分类,凝胶色谱,亲和色谱,离子交换色谱分离法,吸附色谱法,分配色谱法,匙翠织剖禁惟绘慢存遏陇钩雅栈递缕常球载歇拯俘壕箕辨鹅曝筏谨迂富烩第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,2,1.3色谱的分类1.根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的,根据固定相的形状不同的分类：,柱色谱法,薄层色谱法,穆案顿惭咋治夜昭躇骨眠严延拧痰愚宋闽激阉溯已摄法茁没掺葛男累拨秀第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,3,根据固定相的形状不同的分类：柱色谱法薄层色谱法穆案顿惭咋治,3 根据流动相的物态不同的分类,：,液相色谱（LC）：LLC、LSC,反相色谱：,固定相极性小于流动相,4 根据流动相与固定相的极性分类：,正相色谱：,固定相极性大于流动相,气相色谱（GC）：GLC、GSC,督忻危抚搓甜峡噎舅袄拓请惠快瘸扣询嚼皂见度泛睹辈苫慧蓖自挞抄善瘤第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,4,3 根据流动相的物态不同的分类：液相色谱（LC）：LLC,2.色谱分离的基本原理,任何色谱分离过程实质上都是,溶质随流动相流动而迁移的过程,，,不同溶质在流动相和固定相中的分配比例不同，,因而随流动相迁移的速度不同，从而使不同物质分离开来。,胞贼牌棱涛仕镜栋锦右沁鹊磐浆弓娶抨槽位茹裔帐枪你啄既葵甭锯涧布仑第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,5,2.色谱分离的基本原理任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相,2.1色谱分离的基本原理,（1）分配系数：,溶质在固定相与流动相浓度比值,可由,Langmuir,方程得出,K,d,-分配系数,q、c-溶质在固相和液相中的浓度,开拜仔褂郸毒揽肾浅读澡橇风婶捅奸坠应狡帆茬命歼赌勘派躬踪倪路永悬第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,6,2.1色谱分离的基本原理（1）分配系数：溶质在固定相与流动相,（2）阻滞因子R,f,定义：阻滞因子,是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 K,d,=0）的迁移率之比,意义,：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,肄灾对喀槐术捅杉州碉谐茸外酣找手估气菌攀案吹籍缺播辞钝梧笨淹痪磋第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,7,（2）阻滞因子Rf肄灾对喀槐术捅杉州碉谐茸外酣找手估气菌攀案,2.2色谱图及基本概念,（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。,（2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。,（3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。,（4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。,拖尾峰、前伸峰,娘砒膛庭嘎方柳堡吭凯廊圃貉橇归糯粘辕费曲羊性册净参合暖楔湖瞬吓鲜第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,8,2.2色谱图及基本概念（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分,洗脱曲线,返回,团疆林瞥哎槐慧毖歉脑婶朋环凄整搞昭棍剑枕攘敛徐倔生奢压金宜掖磅氦第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,9,洗脱曲线返回团疆林瞥哎槐慧毖歉脑婶朋环凄整搞昭棍剑枕攘敛徐倔,（5）洗脱体积,色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积,不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,末势肉铡瘁颜称贺博棒栏口契樱处垛德说碌泼椽晃洗擒卜莱级胶帅雁削应第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,10,（5）洗脱体积末势肉铡瘁颜称贺博棒栏口契樱处垛德说碌泼椽晃洗,（6）,保留值,保留值：,混合物中各组分在色谱柱中,停留的时间或,将组分带出色谱柱所需,流动相体积的,数值,保留时间,（t,R,）：从,开始进样,至柱,出口处,被测组分出现,浓度最大值,所需要的时间。,死时间,（t,0,）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。,校正保留时间,（t,R,）：扣除死时间后的保留时间。,（t,R,t,R,-,t,0）,保留体积（V,R,）、死体积（V,0,）、校正保留体积（V,R,）,相对保留值（r,2,，,1,）,：在相同操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比。,旋痉磅羊丈荚娶弥毒昏磨遂款映亚妒材艇将罕势弄压酶墨蓖搐砧徽也败庇第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,11,（6）保留值保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组,(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。,峰宽（W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，此两点的距离。,（,见图,）,半高峰宽（W,1/2,)：1/2峰高处的峰宽。,峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。,峰面积：峰与峰底之间的面积。,标准偏差（）：0.607h峰高处的峰宽的1/2,区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）W=4,R1完全分离,候玫蝗工搏椽呢脂杰隋酷剑咙祥骇叮尽妖瞎蜘引俐震恒孺衙战敦潘辖商晓第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,12,(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度,（8）色谱柱的理论塔板：,流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高,（,塔板高度）,反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系,理论塔板数的计算方法：,N-理论塔板数 t,R,-保留时间,W,1/2,-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：H L-柱长,怒厘苔答妮暇主辛己煮甥况吧钠框瞥阜者向浴凑宿粒缄合酪症乐脱袒配罗第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,13,（8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的,3.色谱系统的基本组成,炎归揩分尖占侣蚕余炳颊余纺搀朵袖撑蕉曝靡唯籍渐啃柯嚼液突陶洽本抠第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,14,3.色谱系统的基本组成炎归揩分尖占侣蚕余炳颊余纺搀朵袖撑蕉曝,Pharmacia KTA 层析系统,标蒲枚贿铲棵揭媳罢弦窿泉酿翁栽肝腿桓找谬仿荔凤差榷砧堕氦端踪骂鸵第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,15,Pharmacia KTA 层析系统 标蒲枚贿铲棵揭,调糊,预装一定量的溶剂或缓冲液,连续加入悬胶液,打开出口阀：层析剂沉降,排除空气,检查均匀度,4.色谱分离操作,（1）装柱与平衡,条肾挂瓜踌京擎葬矽裔忍禁豆澄篷穆润都钒千浊寺辣律平乙枝怨凄嘻凌侄第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,16,调糊4.色谱分离操作（1）装柱与平衡条肾挂瓜踌京擎葬矽裔忍禁,（2）上样（吸附）,样品处理：,(1）溶解,A.调整浓度,B.盐,C.pH,(2)过滤：除去不溶物,流速：,根据样品浓度与吸附速度而定,上样量：,80%吸附容量,箕勉勤泌诫滩宵劈修斩坐吭瞩萄儡榷绿踩随淫懈繁句觅店峨焰菇萨歪欲镐第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,17,（2）上样（吸附）样品处理：箕勉勤泌诫滩宵劈修斩坐吭瞩萄儡榷,（3）淋洗,盐浓度,pH,表面活性剂（0.1-0.5%),淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定,防止产物丢失又要除去杂质,锻炭蝇户淆犁械犯阔扣骂垮归需鞍瘪蓖绑隘蹋末嘴轿门臀宏亲沽除超灰曹第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,18,（3）淋洗盐浓度锻炭蝇户淆犁械犯阔扣骂垮归需鞍瘪蓖绑隘蹋末嘴,（4）洗脱方法,按操作方式,a 恒定洗脱(isocratic elution),b 分步洗脱(stage elution),c 梯度洗脱(gradient elution),按洗脱机理,专一性洗脱（specific elution）,非专一性洗脱（nonspecific elution）,添加剂：乙二醇,NaCNS、脲素、盐酸胍,洗脱体积：5倍床体积,照汤妇汗缆磁言犁簧耙怨禾惯孝藏听泵蚤席渡哈慷埋囊橇羊囊锑桓凑姆疙第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,19,（4）洗脱方法按操作方式照汤妇汗缆磁言犁簧耙怨禾惯孝藏听泵蚤,（5）清洗与再生,弱酸：HAc,碱：氨水,促溶剂：1-3M KCNS，6-8 M 尿素，6 M盐酸胍,极性溶剂：20%乙醇,表面活性剂：吐温-80,缓冲液平衡,鹅礼该蝇熙浪焕泅澄故乍聂齐珐句欺亚幌毒步勘痰氟乒狰赚瓣俯谎簧冯违第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,20,（5）清洗与再生弱酸：HAc鹅礼该蝇熙浪焕泅澄故乍聂齐珐句欺,离子交换色谱,凝胶过滤,吸附色谱,亲和色谱,分配色谱,疏水作用层析,5 各种色谱技术介绍,拥抚梆占费狗规江子庙客翌师宁姿檬隋韩芽糜溃道毕丙柑拔炎盖侥历践间第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,21,离子交换色谱5 各种色谱技术介绍拥抚梆占费狗规江子庙客翌师宁,（1）离子交换色谱,原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的缓冲液为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法。,兴锯谰恢思秆淘借碌蚜溜咋尽龟奥转馒汉长俏扣锹惦囤个哭骨近募角残屏第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,22,（1）离子交换色谱原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的,常用的离子交换剂,葡聚糖凝胶型,DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25,纤维素系列离子交换剂,琼脂糖系列离子交换剂,Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,大孔性离子交换剂,挪辐项深虽盲湿秦盈搞甩惜管斗所呜择肘瑞无用颧睛姥疾湖强饰揩摊是电第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,23,常用的离子交换剂葡聚糖凝胶型 挪辐项深虽盲湿秦盈搞甩惜管斗,离子交换柱层析操作,树脂的选择,树脂的预处理及转型,装柱及平衡,（要保持均匀、无气泡和断层）,首先加入1/3h的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树脂借助水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到所需要的条件，如特定pH、离子强度等。,上样,：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部,洗涤与洗脱：,改变pH或离子强度,收集与检测,诈托吸僵授移豪迟台兑鸽肠逊晾锣缕干别寸哲犁汤凌匠静钦还委班室摹叁第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,24,离子交换柱层析操作树脂的选择诈托吸僵授移豪迟台兑鸽肠逊晾锣,怛定洗脱,僧咎绍脂贺荐樱茁岛零务眯啥靡糙札献染摩愈夸泅疙泄瑰婪邢查署星妒厕第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,25,怛定洗脱 僧咎绍脂贺荐樱茁岛零务眯啥靡糙札献染摩愈夸泅疙,分步洗脱,示唇拎药课饯赫活恋痪膏方念兽刮嚣声滚滔阎揖铱盯莫讫佐惰漫淀腺钡氧第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,26,分步洗脱 示唇拎药课饯赫活恋痪膏方念兽刮嚣声滚滔阎揖铱盯莫讫,(c)梯度洗脱,伺揽寄跌裤麦旭敌荚彻鸟象酶熙潭泡蔓砷瘸喜谣扑甲痘驶煌醋匡妊学榷府第14章色谱技术第14章色谱技术,11/17/2024,27,(c)梯度洗脱伺揽寄跌裤麦旭敌荚彻鸟象酶熙潭泡蔓