BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,BSA,毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用,02化工专业：伍品端,指导老师：马志玲 副教授,BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用,1,目录,.研究意义和研究现状,.实验部分,.结果与讨论,.实验创新点,目录.研究意义和研究现状,2,.研究意义和研究现状,手性分离的重要性,生物大分子几乎都具有“,手性,”特征。,手性,药物各对映体的药效学等可能存在很大的差异。,因而评价手性药物各对映体的生物学活性,建立快速、准确、灵敏的,对映体拆分,方法具有十分重要的意义。,.研究意义和研究现状手性分离的重要性,3,拆分对映体的,色谱技术,：,高效液相色谱,高效毛细管电泳,超临界流体色谱,毛细管区带电泳,胶束电动色谱,毛细管电色谱（,CEC,）,(,以电渗流为驱动力的微柱液相色谱技术,),对映体,分离机理,：,手性选择剂与对映体主要为,疏水和静电作用,，,只有具备特定,空间构形,和化学官能团的分子才能与这一区域结合。,.研究意义和研究现状,拆分对映体的色谱技术：毛细管区带电泳对映体分离机理：,4,CEC,的,优点,：,CE,LC,CEC,高效性,高选择性多功能性,高效性、高选择性、多功能性,.研究意义和研究现状,CEC的优点：CELCCEC高效性高选择性多功能性高效性、高,5,常用,CEC,手性选择剂,人血清白蛋白、,牛血清白蛋白,(BSA),、抗生素蛋白、卵类粘蛋白、,-,酸性糖蛋白,等。,手性引入,方法,柱前手性衍生化法,手性流动相添加剂法,手性固定相法,.研究意义和研究现状,常用CEC手性选择剂手性引入方法.研究意义和研究现状,6,总之，,CEC,以样品与固定相之间的相互作用为分离机理，以电渗流为流动相驱动力。不仅具有,CE,水平的,高柱效,，而且具有,HPLC,水平的,高选择性,。,而且，,CEC,整体柱在,手性分离,中也显示出一定优势。,.研究意义和研究现状,返回,总之，CEC以样品与固定相之间的相互作用为分离,7,.实验部分,毛细管处理,在毛细管内聚合整体柱基质,用动态法在聚合整体柱基质上键合,BSA,蛋白,使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离,1.仪器和试剂（略）,2.实验方法,.实验部分毛细管处理在毛细管内聚合整体柱基质用动态法在聚合,8,二、在毛细管内合成整体柱,返回,单体,交联剂,二、在毛细管内合成整体柱返回单体交联剂,9,三、键合,BSA,蛋白,Epoxy method,返回,三、键合BSA蛋白Epoxy method 返回,10,四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。,返回,分离对象：,D,L,组氨酸,分离条件：,运行缓冲溶液：,2mM,磷酸盐缓冲液,分离电压：,6kV,检测方法：,电导检测,四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。返回分离对象：D,11,.实验结果与讨论,一、整体柱基质聚合条件的优化,二、整体柱分离,D,L-,组氨酸对映体,.实验结果与讨论一、整体柱基质聚合条件的优化,12,活性基团,IR,渗透性,背压,孔结构,SEM、,氮吸附法,整体柱基质聚合条件的优化,表1 整体柱各性能的影响因素,最佳聚合条件,单体含量 交联剂含量 致孔剂含量,活性基团,渗透性,孔结构,活性基团IR整体柱基质聚合条件的优化表1 整体柱各,13,环氧活性基团,IR,环氧基,和酯基分别,在约,910cm,-1,和,1730cm,-1,处有吸收。,图1 整体柱基质的红外光谱图,环氧活性基团IR 环氧基和酯基分别在约91,14,单体含量对整体柱活性基团含量的影响,固定致孔剂和溶剂的含量,，,改变单体,（）,和交联剂,（）,相对,含量,，用红外光谱法比较,环氧基吸收峰,（约910,cm,-1,）,和,酯基吸收峰,（约1729,cm,-1,）,峰面积。,返回,样品号 单体/交联剂 环氧基峰面积 酯基峰面积 环氧基与酯基峰面积之比,1,3：2,33.4055 59.3904 0.5625,2,1：1 26.8072 49.1596 0.5453,3,2：3 26.3245 53.5184 0.4919,表2 环氧基与酯基峰面积比较,单体含量对整体柱活性基团含量的影响 固定致孔剂和,15,1.,交联剂,含量对整体柱背压的影响,原因：随着交联剂用量的减少，相分离提前，使孔径 增大。,样品号,单体/交联剂（,v/v),流速（,mL/min),背压（,MPa）,C3,#,3:2,0.005 3.4,C6,#,1:1 0.005 4.7,C7,#,2:3 0.005 5.2,表3 不同交联剂含量的整体柱基质背压,1.交联剂含量对整体柱背压的影响原因：随着交联剂用量的减少，,16,2.,致孔剂,含量对整体柱背压的影响,随着致孔剂（非良性溶剂）用量增大，相分离提前，孔径增大。,返回,图2 不同致孔剂含量整体柱基质背压,2.致孔剂含量对整体柱背压的影响随着致孔剂（非良性溶剂）用量,17,孔结构,SEM,图3,K1,#,（,50%,致孔剂）,SEM,图,图4,K5,#,（,10%,致孔剂）,SEM,图,样品号 单体 交联剂 溶剂 致孔剂,K1,24 16 10 50,K5,24 16 50 10,表4 整体柱基质组成,孔结构SEM图3 K1#（50%致孔剂）SEM图图,18,孔结构,氮吸附法,该整体柱基质的孔都是中孔和大孔，孔径分布在50,nm-90nm,范围内最多。,图5,K1,#,（,50,致孔剂,）,孔径分布图,返回,孔结构氮吸附法 该整体柱基质的孔都是中孔和大孔，孔,19,单体,:24%,交联剂,:16%,致孔剂,:50%,溶剂,:10%,整体柱基质聚合条件,返回,单体:24%整体柱基质聚合条件返回,20,CEC,分离组氨酸对映体结果,在,6.0kV,的分离电压下，以,2mmolL,1,，,pH5.5,磷酸盐缓冲溶液作运行液，分离,D,L-,组氨酸，所得,CEC,图。,图6,D,L-,组氨酸,CEC,图,CEC分离组氨酸对映体结果 在6.0kV的分离,21,表5 缓冲液的,pH,值对分离效果的影响,结论,缓冲液作运行液的,pH,值越高，,BSA（pI=4.7）,离解的负电荷越多，使正的电渗流越强，使保留时间越早。,较高,pH,值的缓冲液作运行液时分离度下降是由于，正的电渗流较强，待分离对映体与手性选择剂的作用来不及很好地进行，就被带出毛细管。,返回,缓冲液,pH,L-,组氨酸,t,R,（min）,D-,组氨酸,t,R,（min）,分离度,R,5.0 ,5.5 6.23 6.68 1.0,6.0 5.02 5.56 0.4,表5 缓冲液的pH值对分离效果的影响结论返回缓冲液pH,22,实验创新点,通过条件实验，用,IR、,测定背压、,SEM,和氮吸附法等方法，确定出,最佳,聚合,条件,，,成功制备,出,毛细管电色谱柱,。,用手性毛细管电色谱柱分离组氨酸对映体，并考察了运行缓冲液,pH,值对,柱效及,分离,度,的影响,并从,原理上,作出,解释,。,最简便的方法（环氧基法），用,BSA,蛋白对毛细管整体柱进行修饰，,制成手性,毛细管电色谱柱。,首次,建立了采用,IR,法,定性和,定量,分析整体柱基质表面的活性基团。,实验创新点 通过条件实验，用IR、测定背压、SEM和氮吸,23,前景展望,目前，,CEC,在药物分析方面已有广泛的研究，集中在与药物相关的杂质分离和,手性药物,的,分离,等。,随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高，将在生物技术、环境保护、农业化学、精细化工产品、食品工业等,多个领域,的分析中得到应用。,在可预计的将来，,CEC,作为一种发展中的,快速分离技术,，将有更广泛的应用前景。,前景展望 目前，CEC在药物分析方面已有广泛的研究,24,致谢,感谢创新化学实验与研究基金项目,感谢导师马志玲副教授的悉心指导,感谢凌连生、谢天尧、曾锋、邹世春等老师的关心和帮助,感谢师兄师姐和朋友们对我的鼓励和帮助,致谢感谢创新化学实验与研究基金项目,25,谢谢！,谢谢！,26,