手足口病的实验诊断

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,手足口病的实验诊断,安徽省疾病预防控制中心,2009,.3,.,11,手足口病的病原,手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）由人肠道病毒感染引起。,人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。,30nm,二十面体对称,无包膜,人肠道病毒的毒粒结构,人肠道病毒发现的历史,脊髓灰质炎病毒,：,1909年,首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。,柯萨奇病毒,：,1948年,在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。,埃可病毒,：,1951年,在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。,新肠道病毒,：,随后,新发现的病毒被按照序号命名（6971），最近，已经命名至102型,肠道病毒主要血清型,手足口病的常见致病病原,多种肠道病毒都可引起,HFMD,，主要为：,柯萨奇病毒A组的47、9、10、16型,B组的13、5型,埃可病毒的部分血清型,肠道病毒71型,最常见的为CV-A16和EV71,肠道病毒的抵抗力,肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。,对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56 30min都能灭活病毒,病毒在4可存活1年，-20可长期保持感染性,病毒RNA有感染性。,（一）粪便标本,采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,（二）脑脊液标本,出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病的标本采集,手足口病的标本采集,（三）血清标本,采集急性期(发病05天)和恢复期(发病1430天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集(发病720天)血。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保存。,（四）咽拭子标本,采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,（五）疱疹液,可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病的标本采集,标本采,集,集器械,要,要求,注射器,：,：医用,（,（5ml和10ml,）,）一次,性,性注射,器,器,棉拭子,：,：塑料,杆,杆,全血收,集,集管：10ml螺口,塑,塑料管(外螺,旋,旋、带,密,密封垫,圈,圈),血清保,存,存管：2 ml螺口,塑,塑料管(外螺,旋,旋、带,密,密封垫,圈,圈)，,可,可耐深,低,低温（,液,液氮保,存,存）,粪便保,存,存管：5-20 ml螺口,塑,塑料管(外螺,旋,旋、带,密,密封垫,圈,圈)，,可,可耐深,低,低温（,液,液氮保,存,存）-,全,全国POLIO网络,实,实验室,鼻咽拭,子,子保存,管,管：10 ml螺口,塑,塑料管(外螺,旋,旋、带,密,密封垫,圈,圈)，,可,可耐深,低,低温（,液,液氮保,存,存）,痰液保,存,存管：50ml螺,口,口塑料,管,管(外,螺,螺旋、,带,带密封,垫,垫圈),，,，可耐,深,深低温,（,（液氮,保,保存）,尸检组,织,织冻存,管,管：50ml,螺,螺口塑,料,料管(,外,外螺旋,、,、带密,封,封垫圈)；尸,检,检（每,一,一个样,品,品换手,术,术刀）,记号笔,：,：油性,，,，防水,标本采,集,集器械,要,要求,病人标,本,本的采,集,集运输,和,和保藏,在手足,口,口病的,实,实验室,诊,诊断中,，,，从疱,疹,疹液或,脑,脑脊液,中,中,分,分离病,毒,毒具有,很,很高的,诊,诊断价,值,值。,用于采,集,集咽拭,子,子的无,菌,菌拭子,要,要放在,适,适当的,保,保存液,中,中，如,维,维持液,或,或生理,盐,盐水，,以,以防干,燥,燥。,标本采,集,集注意,事,事项,标本采,集,集注意,事,事项,为了保,证,证检测,结,结果的,准,准确性,和,和有效,性,性，标,本,本应在,病,病例发,病,病后尽,早,早采集,，,，尽快,检,检测。,不能立,即,即检测,的,的标本,应,应冷冻,保,保存。,对于血,清,清学诊,断,断，急,性,性期血,清,清应该,在,在发病,后,后尽早,采,采集，,恢,恢复期,血,血清在,发,发病2-4周,后,后采集,。,。,手足口,病,病的诊,断,断一般,是,是通过,采,采集适,当,当的临,床,床标本,后,后进行,基,基因检,测,测、抗,原,原检测,、,、血清,学,学抗体,检,检测、,病,病毒分,离,离和病,鉴,鉴定,手足口,病,病的实,验,验室诊,断,断,手足口,病,病的实,验,验室诊,断,断方法,病毒分,离,离,抗体检,测,测,核酸检,测,测,蛋白/,核,核酸芯,片,片,标本,病毒分离,CPE阳性,RT-PCR,及序列测定,肠道病毒,非肠道病毒,测双份血清,中和抗体滴度,RT-PCR,Real time RT-PCR,检测病毒核酸,序列测定,无CPE,常规实验,补充实验,中和定型,手足口,病,病的实,验,验室检,测,测流程,病毒分,离,离培养,用于病,毒,毒分离,的,的标本,：,：,包括粪,便,便、咽,拭,拭子和,疱,疱疹液,，,，如果,患,患者出,现,现神经,系,系统症,状,状，可,以,以采集,脑,脑脊液,标,标本,适用的,细,细胞,RD细,胞,胞（人,胚,胚胎横,纹,纹肌肉,瘤,瘤细胞,）,）、Hep-2细胞,（,（人喉,上,上皮癌,细,细胞）,病毒分,离,离培养,标本的,处,处理,1、粪,便,便：2g 加PBS10ml，,振,振荡混,匀,匀，1500g低温,离,离心20min，上,清,清0.2ml,接,接种敏,感,感细胞,2、咽,拭,拭子：,于,于采样,管,管中充,分,分洗涤,拭,拭子，4,下,下 10000rpm离心20min，,上,上清0.2ml接种,敏,敏感细,胞,胞,3、脑,脊,脊液和,疱,疱疹液,：,：直接,接,接种,病毒分,离,离培养,培养观,察,察：,36,培,培养逐,日,日观察,，,，第1,代,代培养,见,见可疑CPE,至,至观,察,察满7,天,天后再,继,继续冻,融,融传代,，,，待稳,定,定CPE出现,后,后,-20,或,或-70,冻,冻存以,备,备进一,步,步鉴定,；,；,如果,7,天之后,没,没有出,现,现CPE，需,盲,盲传,2,代继续,观,观察，,盲,盲传,2,代后仍,不,不出现CPE,则,则判定,为,为阴性,；,；,鉴定：,中,中和试,验,验,血清抗,体,体检测,方法,中和实,验,验、ELISA,IgM,：,：单份,血,血：急,性,性期,IgG,：,：双,份,份血：,急,急性期,，,，恢复,期,期,阴转阳,，,，四倍,升,升高，,四,四倍降,低,低均可,诊,诊断近,期,期感染,病毒核,酸,酸检测,RT-PCR,RT-PCR(ReverseTranscriptase PCR),用于,RNA,病毒的,检,检测，,酶,酶促催,化,化使,RNA,逆转录,成,成,cDNA,第一链,，,，逆转,录,录与第,一,一次,PCR,在同一,系,系统内,进,进行，,逆,逆转录,完,完成后,，,，加热,灭,灭活逆,转,转录酶,，,，然后,开,开始,PCR,扩增。,一,一条寡,聚,聚脱氧,核,核苷酸,引,引物先,与,与,mRNA,杂交，,然,然后由,依,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶,催,催化合,成,成相应,互,互补的,cDNA,拷贝，,后,后者能,进,进一步,用,用于,PCR,扩增。,病毒核,酸,酸检测,RT-PCR,方法特,点,点：,快捷、,简,简便,高度灵,敏,敏、特,异,异,具有病,原,原诊断,意,意义,高效的,通,通用型,技,技术平,台,台,粪便标,本,本：,采用氯,仿,仿进行,处,处理。,肛拭子/咽拭,子,子标本,：,：,咽拭子,要,要在标,本,本保存,液,液中充,分,分搅动,，,，然后,在,在4,下,下，10000 rpm离,心,心20min,。,。,疱疹液,和,和脑脊,液,液：,直接用,于,于RNA提取,。,。,标本的,预,预处理,可使用,商,商业化,试,试剂盒,从,从临床,标,标本中,提,提取病,毒,毒RNA,简化操,作,作、规,范,范方法,、,、条件,一,一致、,排,排除干,扰,扰,QIAGENViralRNA MiniExtractionKit,（,（CAT：52904）适,合,合临床,标,标本和,病,病毒培,养,养物标,本,本,QIAGENRneasyMini Kit（CAT,：,：74104）,适合组,织,织和咽,拭,拭子标,本,本,RNA,的,的提取,引,物,物,人肠道,病,病毒（,包,包括EV71,、,、CA16、CA24v、EV70）核,酸,酸检测,通,通用引,物,物,PE2,（上游,）,）,：,5-TCC GGCCCCTGA ATGCGGCTA ATCC-3,PE1,（下游,）,）,：,5-ACA CGGACACCC AAAGTAGTC GGTCC-3,EV71,核酸检测引,物,物序列：,EV71-S（,上游）：,5-GCA GCC CAA AAGAACTTC AC-3,EV71-A（,下游）：,5-ATT TCA GCA GCTTGGAGT GC-3,引 物,CA16,核酸检测引,物,物序列：,Cox A16-S（,上游）：,5-ATT GGTGCTCCC ACT ACA GC-3,Cox A16-A（,下游）；,5-TCA GTGTTGGCA GCT GTA GG-3,引 物,根据自己实,验,验室的实际,情,情况建立各,自,自RT-PCR反应体,系,系,配下列试剂,主,主溶液：,10PCR Buffer,（含,Mg2+,）,5.0l,dNTPs,（,（2.5mM each）,2.0l,上游引物（0.1g/l）,1.0l,下游引物（0.1g/l）,1.0l,RNA酶抑,制,制剂（RNasin,40U/l）,0.5l,Taq DNA聚合酶,（,（5U/l）,0.5l,AMV逆转,录,录酶（10U/l）,1.0,l,模板RNA,3.0l,RNaseFreedH2O,36.0l,50.0l,反应体系,在PCR仪,上,上进行RT-PCR反,应,应，反应步,骤,骤如下：,42,45min,95,3min,95,20s,50,25s,32个循环,72,30s,72,10min,4,Soak,温度循环参,数,数,通过比较标,本,本的PCR,产,产物与阳性,对,对照的PCR产物在凝,胶,胶上的位置,以,以及大小来,解,解释结果。,结果解释,RT-PCR,实验结果解,释,释,实验室诊断,原,原则,人肠道病毒,在,在自然界广,泛,泛存在且种,类,