制药微生物菌种建立课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,项目二 微生物发酵制药工艺,2.1,概述,2.2,微生物生长与生产的关系,2.3,制药微生物菌种建立,2.4,制药微生物培养基制备,2.5,灭菌工艺,2.6,微生物发酵培养技术,2.7,发酵工艺过程的检测与控制,项目二 微生物发酵制药工艺2.1 概述,2.3,制药微菌种的建立,2.3.1,新药生产菌种的选育,2.3.2,菌种保藏,2.3.3,菌种库建立与质量控制,发酵制药,生产菌种的建立,2.3 制药微菌种的建立2.3.1 新药生产菌种的选育发酵制,制药生产对菌种的要求,1.,遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种，无杂菌及噬菌体。,2.,易生长性：生长旺盛、迅速；,4.,容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。,3.,抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。,4.,经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。,5.,突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。,菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用,制药生产对菌种的要求1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退,2.3.1.1,自然分离,目的：出发菌的获取,样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体,预处理：根据分离目的和微生物的特性。,温度；化学处理；离心、膜过滤,培养基：选择性，营养和,pH,；添加抑制剂。,分离方法：,（,1,）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液,（,2,）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。,培养条件：温度。放线菌：,25,30,，,32,37,，,45,50,；,7,14,天至,1,月。,发酵制药,生产菌种的建立,2.3.1.1 自然分离目的：出发菌的获取发酵制药生产菌种的,药物的筛选,琼脂扩散法,活性测定：,非致病菌为对象，筛选生物活性物质。,耐药和超敏菌种。,HPLC,、,LC,MS,等，分析鉴定活性物质。,靶向筛选,高通量筛选,高内涵筛选,发酵制药,生产菌种的建立,药物的筛选琼脂扩散法活性测定：发酵制药生产菌种的建立,微生物药物与菌种的筛选流程,样品采集,微生物分离,培养,筛选鉴定,筛选方法学建立,阳性结果,化合物分离纯化鉴定,前药新化合物,新药研究与开发,菌种鉴定与保藏,生产出发菌,发酵制药,生产菌种的建立,微生物药物与菌种的筛选流程样品采集微生物分离培养筛选鉴定筛选,2.3.1.2,生产选育,概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。,应用,：（,1,）,菌种的提纯复壮。（,2,）防止退化，稳定生产水平。,1,年,1,次。,过程,菌种,单孢子,单菌落测活,平板分离,优良菌株,效率低（,2,E5,E8,），增产幅度小,发酵制药,生产菌种的建立,2.3.1.2 生产选育概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的,2.3.1.3,诱变育种,概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。,物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。,化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。,生物类：噬菌体，转座子。,特点：快速，简单，效益大。,缺点：无定向性，大量筛选。,发酵制药,生产菌种的建立,2.3.1.3 诱变育种概念：人为创造条件（诱变剂处理），使,诱变方案设计,出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。,诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（,80,致死率）。,选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。,发酵制药,生产菌种的建立,诱变方案设计出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。发酵制药生,诱变育种流程,出发菌种,单孢子悬液,稀释涂板,单菌落初筛,高产菌株,诱变处理,稳定性,特性,放大中试,复筛,投入生产,发酵制药,生产菌种的建立,诱变育种流程出发菌种单孢子悬液稀释涂板单菌落初筛高产菌株诱变,2.3.1.4,原生质体融合育种,概念,通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。,特点：有一定的定向性，效果显著。,发酵制药,生产菌种的建立,2.3.1.4 原生质体融合育种概念发酵制药生产菌种的建立,d.,筛选，鉴定,e.,高产菌株,a.,原生质体制备：,用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体。,操作过程,hybrid cell,c.,细胞壁再生,b.,原生质体融合：,异核体或重组子,菌株,1,菌株,2,去细胞壁,原生质体,1,原生质体,2,高渗，,PEG,处理,杂合原生质体,发酵制药,生产菌种的建立,d.筛选，鉴定e.高产菌株a.原生质体制备：操作过程hyb,2.3.2,菌种保藏,原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。,目的：,保持菌种,原有,优良特性,，延长生命时限,，,长期存活、不退化，不污染，随时为生产供菌。,原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。,措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）,发酵制药,生产菌种的建立,2.3.2 菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，,保藏方法比较,方法名称,主要措施,适宜菌种,保藏期,评价,冰箱保藏法,（斜面）,冰箱保藏法,（半固体）,石蜡油封藏法,沙土保藏法,冷冻干燥法,低温,低温,低温、缺氧,干燥、无营养,干燥、无氧、低温、有保护剂,各类,细菌、酵母菌,各类,产孢子微生物,各类,3,6,月,6,12,月,1,2,年,1,2,年,5,15,年以上,简便,简便,简便,简便有效,简便有效,发酵制药,生产菌种的建立,保藏方法比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法低温,2.3.3,菌种库建立与质量控制,依据：,GMP,对药品生产的有关要求和规定,建立各级种子细胞库，实施种子批系统管理，进行验证,确保菌种的稳定、无污染，保证生产正常有序进行。,发酵制药,生产菌种的建立,2.3.3 菌种库建立与质量控制依据：发酵制药生产菌种的建立,建库的流程,WCB,QC,WCB,QC,QC,MCB,新菌种或细胞系,原始培养物,QC,质保实验室，繁殖,保存实验室，繁殖,主菌种库,MCB,：来源于原始菌种或细胞培养物,工作菌种库,WCB,：由主菌种库或主细胞库繁殖而来。,发酵制药,生产菌种的建立,建库的流程WCBQCWCBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培,菌种库的质量管理,细胞类型,质量控制（,QC,）内容,细菌,活性，纯度，真实性，革兰氏染色，形态特征，生化特征，遗传特征,真菌,活性，纯度，真实性，形态特征，生化特征，遗传特征,基因工程菌,宿主菌特征，表达质粒结构与功能，鉴别标志，基因序列，稳定性，表达方式与水平,动物细胞系,活性，纯度，真实性，无菌实验，核型，,DNA,分析（如指纹图谱），同工酶分析，支原体试验，其他外源物试验，稳定性和基因型分析,发酵制药,生产菌种的建立,菌种库的质量管理细胞类型质量控制（QC）内容细菌活性，纯度，,保藏机构中国,中国典型培养物保藏中心,:China Center for Type Culture Collection(CCTCC),。,中国科学院典型培养物保藏委员会,下设,9,个库,中国普通微生物菌种保藏管理中心：,China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC),，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）,抗生素菌种保藏管理中心（,CACC,）：中国医学科学院抗生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所,发酵制药,生产菌种的建立,保藏机构中国中国典型培养物保藏中心:China Cente,保藏机构国外,WFCC,：,World federation for culture collections,http:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml,美国的典型菌种保藏中心,ATCC:American Type Culture Collection,http:/www.atcc.org/,日本发酵研究所,IFO:Institute for Fermentation,Osaka,Japan,英国国家典型菌种保藏所,NCTC:National Collection of Type Culture,London,UK,发酵制药,生产菌种的建立,保藏机构国外WFCC：World federation f,小结与要求,生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生产选育、诱变和原生质体融合、,Shuffling,，提高菌种生产性能,菌种保藏：防止失活和退化（物理手段）,建立菌种库：,GMP,的要求，质量控制，保证生产菌种活力和供给,了解菌种选育和保存的方法及其原理,理解其生产应用价值，掌握突变和原生质体育种技术,能设计育种研究方案和能实际应用。,发酵制药,生产菌种的建立,小结与要求生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生产选育、诱变,思考题,（,1,）如何进行生产菌的分离与筛选？,（,2,）比较各种菌种选育方法的优缺点。,（,3,）菌种保藏的原理是什么？有那些主要方法，各有何优缺点？,发酵制药,生产菌种的建立,思考题（1）如何进行生产菌的分离与筛选？发酵制药生产菌种的建,