蛋白质工程制药ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,蛋白质工程制药,蛋白质工程制药,1,主要内容,第一节 概述,第二节 蛋白质的分子改造,第三节 蛋白质工程在制药中的应用,主要内容第一节 概述,2,概述,蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。,蛋白质工程制药是蛋白质工程在制药方面的应用。,概述蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计,3,蛋白质工程程序,蛋白质工程程序,4,蛋白类药物的种类,多肽类,蛋白类,蛋白类药物的种类多肽类蛋白类,5,一 蛋白质工程的研究内容,：,1 利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。,2 定量确定蛋白质结构-功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等.,3 从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白质。,4 根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体.,一 蛋白质工程的研究内容：,6,二 蛋白质工程的基本步骤,1 分离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析,得到其空间结构的尽可能多的信息。,2 对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。,3 通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。,二 蛋白质工程的基本步骤,7,4围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。,5对经过改造的蛋白质进行功能性测定.,4围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基,8,三 蛋白质工程的改造策略,1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；,螺旋和折叠区,通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。,2、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。,三 蛋白质工程的改造策略1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动,9,3、应注意保留潜在的N糖基化位点(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的Asn(天门冬酰胺)、Set(丝氨酸)或Thr(苏氨酸)。,4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。,5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。,3、应注意保留潜在的N糖基化位点(Asn-X-SerThr,10,6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。,7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。,6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随,11,第二节、蛋白质的分子改造,在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：,初级改造：,个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入,高级改造,：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接,从头设计合成新型蛋白质,第二节、蛋白质的分子改造 在基因水平上对蛋白质进行改造，按改,12,一、初级改造,通过,基因突变方法,，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。,目前，主要采用的基因突变方法：,基因定位突变,盒式突变,。,一、初级改造,13,基因定位突变,根据三联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。,这种通过造成一个或几个碱基,定点突变,，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术,。,基因定位突变,14,基因定位突变的基本过程,：,首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等)即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。,基因定位突变的基本过程：,15,（1）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术,特点：,能够准确按照人们的意图进行DNA突变，即想改变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变,基本过程：,将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。,（1）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术 特点：能够准确,16,蛋白质工程制药ppt课件,17,（2）寡核苷酸介导的PCR诱变技术,特点：,利用PCR技术定点诱变，可使突变体大量扩增，提高诱变率,以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。,（2）寡核苷酸介导的PCR诱变技术 特点：利用PC,18,过程：,将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特定的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；,两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。,将两管PCR产物混合、变性、复性，则每条链会与另一管中的互补链退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌后，这两个切口均可被修复。若同一管子中的两条DNA链结合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，只有环状DNA才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。,过程：,19,蛋白质工程制药ppt课件,20,（3）盒式突变技术,1985年Wells提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱和性”分析。,（3）盒式突变技术 1985年Wells提出的一种基因修饰技,21,盒式突变是定点突变的一种方式。即在某一氨基酸位点进行“饱和性”突变。系在合成寡核苷酸到某目的改变的氨基酸时，反应系统中同时加入4种dNTP，以期出现每一种密码。将这混合的寡核苷酸引入克隆，并转化宿主，则可能获得在目的位点有各种氨基酸的突变株，有利于研究不同氨基酸对蛋白质的结构和功能的影响。,盒式突变是定点突变的一种方式。即在某一氨基,22,蛋白质工程制药ppt课件,23,蛋白质工程制药ppt课件,24,二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）,研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域。,结构域由螺旋、折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。,结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。,二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）研究证明，在二级结,25,三、全新蛋白质的设计与构建,上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结构，以期达到改变其性质的目的。,如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。,三、全新蛋白质的设计与构建 上述两种蛋白质改造方法，通常是从,26,蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。,提高蛋白的稳定性包括以下几个方面,：,延长酶的半衰期；,提高酶的热稳定性；,延长药用蛋白的保存期；,抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。,第三节 蛋白质工程在制药方面的应用,蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进,27,一、消除酶的被抑制特性,1985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用19种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化的Met，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用Cys代替Met的突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。,一、消除酶的被抑制特性 1985年，美国的埃斯特尔借助寡核,28,二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性,二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性,29,在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。,对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个Asn，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。,通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个Asn分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。,三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性,在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白,30,四、改变酶的最适pH值条件,葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80稳定，而在碱性条件下，80时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60进行。,采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应。,四、改变酶的最适pH值条件 葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在,31,五、提高酶的催化活性,酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定,如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变,在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了，而且最大反应速度亦大幅度提高。,五、提高酶的催化活性 酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定,32,蛋白质工程制药ppt课件,33,六、修饰酶的催化特异性,利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解,-1，4糖苷键和-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变。,七、修饰Nisin的生物防腐效应,Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，,Nisin由34个氨基酸残基构成。,可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏。,是一种天然防腐剂、抑菌剂，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消化成氨基酸。它不会改变肠道内的正常菌群，不会引起抗药性问题，亦不会与其它抗生素出现交叉抗性，各国毒理学试验证明YP-1000 Nisin是安全、无毒副作用的。,六、修饰酶的催化特异性 七、修饰Nisin的生物防腐效应,34,改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。,Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成五个内环。,改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌,35,蛋白质工程制药ppt课件,36,药物设计的改造,药物设计的改造,37,蛋白质工程制药ppt课件,38,作为改变,糖尿病患者,命运的重要发现,胰岛素是糖尿病治