蛋白质电泳技术介绍课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,整理版,*,单击此处编辑母版标题样式,LOGO,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,电泳技术介绍,电泳技术介绍,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PAGE,(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE),2,整理版,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE2整理版,基本原理,1.SDS,能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。,2.,蛋白质样品在,100,用,SDS,和还原剂处理，可解聚成亚基,加入SDS，改变了,蛋白质,的构象,。,3.,各种SDS-,蛋白质复合物,均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原,蛋白质,，消除了不同,蛋白质的,荷电差异。,3,整理版,基本原理1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级,图解,4,整理版,图解4整理版,多孔凝胶,混合大分子,电泳,5,整理版,多孔凝胶混合大分子电泳5整理版,操作流程,制胶,上样,电泳,染色,脱色,6,整理版,操作流程制胶上样电泳染色脱色6整理版,制胶,1,将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好,2,按照配方制备分离胶，,TEMED,在灌胶前加入混匀，迅速灌胶,3,在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面）,4,倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘,5mm,处,迅速插入样梳,静置,40,分钟,具体步骤,7,整理版,制胶具体步骤7整理版,上样,按一定顺序在加样孔中加入样品，根据,SDS-PAGE,电泳玻璃板,间隙厚度不同，选择加入样品量。,电泳,打开电源将电压调到,80v,（一般,15min,左右），待样品跑过压,缩胶后将电压调到,120v,至样品电泳到胶底部为止。,8,整理版,上样8整理版,染色,将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝,），用摇床摇,2,3h,脱色,待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉,，可以用,Quality One,，或者相应的成像系统拍照、分析、,估算蛋白浓度。,9,整理版,染色9整理版,等电聚焦电泳,(Isoelectro focusing IEF or EF),10,整理版,等电聚焦电泳(Isoelectro focusing I,等电聚焦电泳，是利用有,pH,梯度的介质分离等,电点不同,的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可到达,0.01pH,单位，因此特别适合于分离,分子量相近而等电点不同,的蛋白质组分。,适用,:1.,研究蛋白质微观不均一性,2.,测定蛋白质等电点,基本原理,11,整理版,等电聚焦电泳，是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质,4,形成电场,3,蛋白质加样,2,1,用电流在凝胶溶液中建立一个稳定的,PH,梯度,蛋白质移动到它们各自的等电点，不同等电点的蛋白质被分开,12,整理版,4形成电场3蛋白质加样21用电流在凝胶溶液中建立一个稳定的P,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,13,整理版,+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5,pH,梯度构建,载体两性电解质,pH,梯度,(Carrier ampholytes pH gradients,，,CA):,在电场中通过两性缓冲离子建立的,pH,梯度。,固相,pH,梯度（,immobilized pH gradients,，,IPG,）将缓冲基团,共价键合在介质上成为凝胶介质的一部分而建立,pH,梯度（线性和非线性），分辨率比前者高一个数量级。,14,整理版,pH梯度构建载体两性电解质pH梯度14整理版,载体两性电解质（,CA,）应具备的条件,(1),在等电点处必需有足够的缓冲能力,(2),在等电点必需有足够高的电导,(3),分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。,(4),化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。,(5),应不与分离物质反应或使之变性。,15,整理版,载体两性电解质（CA）应具备的条件(1)在等电点处必需有足够,操作流程,1,2,3,4,制胶,装管,装槽，电泳,剥胶,5,固定,6,测定,pH,梯度,16,整理版,操作流程1234制胶装管装槽，电泳剥胶5固定6测定pH梯度1,具体步骤,1.,配胶,2.,装管,每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆,盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂,直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根,玻璃管的容量约为,1.5-1.8ml,）,液面加至距管口,1mm,处，用,注射器轻轻加入少许,H2O,，进行水封，以消除弯月面使胶柱,顶端平坦。胶管垂直聚合约,30,分钟，聚合完成时可观察到水,封下的折光面。,17,整理版,具体步骤1.配胶17整理版,3.,装槽和电泳,用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约,1/3,在上槽，,2/3,在下槽。上槽加入,500ml 0.1M H3PO4,，下槽加入,500ml 0.1M NaOH,，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压,160V,，聚焦,2,至,3,小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。,18,整理版,3.装槽和电泳 18整理版,4.,剥胶,取下胶管，用,H2O,将胶管和两端洗,2,次，用注射器沿管壁轻,轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端,注入,H2O,少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻,挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极,端为“尾”，若分不清时，可用,pH,试纸鉴定，酸性端为正，碱,性端为负。,19,整理版,4.剥胶 19整理版,5.,固定,取,2,支胶条置于一个小培养皿内，倒入,10%,三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“,L2”,和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“,L”,。固定后的胶条可在康强,860,紫外,/,可见分光光度计上用,280nm,或,238nm,波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。,20,整理版,5.固定 20整理版,6.,测定,pH,梯度,将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测,pH,胶条的长度“,L1”,。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成,10mm,长的小段，分别置于小试管中，加入,1ml H2O,，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长,pH,复合电极的,pH,计测出每管浸出液的,pH,值。,21,整理版,6.测定pH梯度 21整理版,优缺点,优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等电点而且能将不同等电点的混合生物大分子进行,分离,和,鉴定,。,缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点,不溶解,或发生,变性,的蛋白。,22,整理版,优缺点优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，,双向电泳,（,2-D electrophoresis,）,23,整理版,双向电泳23整理版,基本原理,第一向进行等电聚焦，蛋白质沿,pH,梯度分离（将适宜的,IPG,试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成,pH,梯度），至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。,24,整理版,基本原理第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离（将适宜的I,第一向,：,等电聚焦电泳,第二向,：,SDS-PAGE,水平方向：反映出蛋白在,pI,上的差异,垂直方向：反映出它们在分子量上的差别,图解,25,整理版,第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS-PAGE水平方向：反映出,2D,电泳操作流程,细胞裂解匀浆,预分级,除杂质,浓缩,定量,样品制备,挖点,酶解,点靶,蛋白鉴定,分离,双向电泳,第一向,第二向,染色,银染 考染 荧光,图谱分析,图像获取,图谱分析,26,整理版,2D电泳操作流程细胞裂解匀浆样品制备挖点蛋白鉴定分离双向电泳,1.,样品制备,2.,固相预制胶条的水化,3.,第一向等电聚焦,3.1.,取出,IPG,预制胶条（,7cm pH 4-7,），室温平衡。,3.2.,在聚焦盘或水化盘中加入样品。,3.3.,去除预制,IPG,胶条上的保护层。,具体步骤,27,整理版,1.样品制备具体步骤27整理版,3.4.,将,IPG,胶条置于聚焦盘或水化盘中。,3.5.,在每根胶条上覆盖,1ml,矿物油。,3.6.,对好正、负极，盖上盖子。,3.7.,设置等电聚焦程序。,4.,胶条的平衡,4.1,冰箱中取出的胶条，于室温放置,10,分钟。,28,整理版,3.4.将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中。28整理版,4.2,配制胶条平衡缓冲液,I,。,4.3,吸去胶条上的矿物油及多余的样品。,4.4,第一次平衡。振荡,15,分钟。,4.5,配制胶条平衡缓冲液,II,。,4.6,第二次平衡，振荡,15,分钟。,4.7,吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。,29,整理版,4.2配制胶条平衡缓冲液 I。29整理版,4.8,琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制,1,电泳缓冲液。,5.,第二向,SDS-PAGE,电泳,6.,凝胶的染色及检测,7.PDQuest,软件分析,8.,质谱鉴定,30,整理版,4.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1电泳缓冲液。30整理,Thank You!,Thank You!,