五毛细管电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,毛,细管电泳分析法,（,Capillary Electrophoresis,CE,）,一,.,概述,二,.,毛细管电泳基本概念和原理,三,.,毛细管电泳的分离模式,四,.,毛细管电泳仪的基本结构,五,.CE,技术的应用,11/15/2024,1,电泳,是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象,.,利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离的技术称之为,电泳技术,。丛,20,世纪,3040,年代起,相继发展了多种基于抗对流介质的电泳技术,(,如,纸电泳,，,凝胶电泳,等,).,传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低,.80,年代初,细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术,毛细管电泳。,毛细管的结构,：毛细管电泳通常使用内径为,25-100m,的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。,一,.,概述,11/15/2024,2,毛细管的,特点,是：容积小；侧面,/,截面积大而散热快、可承受高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。,原理,毛细管电泳,(,CE,),又称,高效毛细管电泳,(,HPCE,),是指离子或带电粒子以,毛细管,为分离室,以,高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间,淌度,和,分配行为,上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大,易于散热，,因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是,CE,和传统电泳技术的根本区别。,11/15/2024,3,CE,开始主要用于,蛋白质，多肽的分析,以后逐渐被广泛应用于,生物,，,化学,，,医药,，,环保,等领域。它具有,分离效率高,，,分析速度快,，,样品及试剂用量少,洁净无污染,等,特点,和,HPLC,(,高效液相色谱法,),成为分析化学中互补的技术。随着生命科学的发展，毛细管电泳技术也有了广阔的发展空间,.,目前，不同分离模式的毛细管电泳技术正成为最重要的生物样品分离分析手段。,11/15/2024,4,根据分离原理分为以下几种类型,毛细管区带电泳（,capillary zone electrophoresis,，,CZE,）；,毛细管等速电泳（,capillary chromatography,，,CITP,）；,毛细管胶速电动色谱（,miceller,electrokinetic,capillary chromatography,，,MECC,）；,毛细管凝胶电泳（,capillary,gelelectrophoresis,，,CGE,）；,毛细管等电聚焦（,capillary,isoelectric,focusing,，,CIEF,）。,11/15/2024,5,二,.,毛细管电泳基本概念和原理,1.,基本概念,有效长度,(,L,d,cm),：毛细管的入口端到检测器窗口的距离；,迁移时间,(,t,m,min),：带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；,电泳速度,（,U,ep,cm/s,）：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向,移动的距离；,电场强度,(,E,V/cm),：在给定长度毛细管的两端施加一个电场后,所形成的电效应的强度；,电泳淌度,（,ep,cm,2,/(V.s),）,带电粒子在毛细管中定向移动的速,度与所在电场强度之比；,11/15/2024,6,电渗流,：毛细管内壁表面的电荷所引起的管内液体的整体流动，,来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用；,电渗流,方向,样品分子泳动方向,1.,基本概念,使液体沿毛细管壁均匀移动；,使携带不同电性的分子均向负极移动，,中性分子也随着电渗流一起移动。,电渗流的,作用特点,11/15/2024,7,毛细管电泳的基本原理：,毛细管电泳,是以高压电场（,30kV,）为驱动力，以毛细管为分离通道。其管内填充了缓冲液或凝胶，根据样品中各组分之间,淌度,和,分配的差异,而实现分离的一类液相分离技术。,在电泳过程中，毛细管两端插入电极液，此电极液通常与管中的缓冲液一致。正负电极连接至高电压装置，进样时样品盘移动，使毛细管的进样端及此端的电极准确插入样品管中，给予一定电场或压力后，样品被吸入毛细管内，然后再将毛细管移至电极液中开始电泳。,在毛细管电泳中，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至石英表面形成双电子层，当在毛细管两端施加电压后，这层正离子趋向负极移动，并带动毛细管中的溶液以液流形式移向负极（,电渗,）。,由于毛细管的表面积与体积比大，加上电泳时使用了高压，,电渗在毛细管电泳中具有两大特点,：,液体,沿着毛细管壁,均匀流动,，其前沿是平的；携带,不同电荷的分子朝一个方向移动,，中性分子也能随着电渗一起移动而实现分离,11/15/2024,8,11/15/2024,9,2.,毛细管电泳基本分离原理,毛细管的两端分别浸在含有电解质的储液槽中，管内也充满同样的电解质,其中一端与检测器相连,.,当样品被引入后,便开始施加电压，样品中各组分向检测器方向移动,溶质的迁移时间为,:,t,m,=l L,t,/UV,L,t,-,有效长度,V-,施加电压,U-,溶质总流速,Uep,-,电泳速度,Ueo-,电渗流速度,U=,U,ep,+,U,eo,其中，,可见，在毛细管长度一定，某时刻电压,相同的条件下，迁移时间决定于,电泳速度,Uep,和,电渗流速度,Ueo,而两者均随组分的不同荷质比而异,;,所以，基于荷质比的差异就可以实现组分的分离。,11/15/2024,10,3,、毛细管电泳仪系统,Come on,11/15/2024,11,三,.,毛细管电泳的分离模式,CE,毛细管区带电泳,毛细管凝胶电泳,胶束电动力学毛细管色谱,毛细管等电聚焦电泳,毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会,.,根据分离原理可分为,:,11/15/2024,12,毛细管电泳的分离模式,（一）毛细管区带电泳（,capillaryzoneelectrophoresis,，,CZE,）：毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液（缓冲液）。它是最基本、应用最普遍的一种分离模式，尤其对于亲水多肽的分离具有一定的优越性。,（二）微团电动毛细管色谱（,micellar,electrokinetic,capillarychromatography,，,MECC,）：通常有一些离子型表面活性剂（如,SDS,）加到缓冲液中，这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核，亲水基团在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分离。,11/15/2024,13,（三）毛细管等电聚焦（,capillary,isoelectric,focusing,，,CIEF,）：选用内壁中性共价涂层消除电渗的毛细管，利用两性电解质形成,pH,梯度。,CIEF,具有较高的分辨力。,（四）毛细管筛分电泳（,capillarysievingelectrophoresis,，,CSE,）：在毛细管内填充了多聚物作为分离介质，如甲基纤维素对分子的泳动起着阻碍作用。其作用机制类似平板电泳凝胶的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减慢。,毛细管电泳的分离模式,11/15/2024,14,（六）毛细管阵列电泳（,capillary array electrophoresis,，,CAE,）：,CAE,是在常规,CE,原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的一种检测技术由微通道或反应池等构成通道型微阵列,芯片,，通过加载生物样品，进行一种或连续多种反应，达到快速高效分析的目的，是一种新型的生物,芯片,。,（七）免疫亲和毛细管电泳（,immunoaffinity,capillary electrophoresis,，,ACE,）：,ACE,是把蛋白质（抗原或抗体）事先固定在毛细管柱内，利用抗原,-,抗体的特异性识别反应，,CE,的高效、快速分离能力，,LIF,的高灵敏度来分离检测样品混合物中能与固定化蛋白质特异结合的组分。,毛细管电泳的分离模式,11/15/2024,15,毛细管区带电泳,毛细管区带电泳,(,CZE,),也,称为,自由溶液毛细管电泳,是毛细管电泳中最简单，,应用最广泛的一种形式。,分离机理：不同离子按照各,自表面电荷密度的差异即,淌度,的差异,以不同的速度,在电解质中移动,实现分离。,但中性物质的淌度差为零,所以不能以这种形式分离。,11/15/2024,16,四、毛细管电泳仪的基本结构,电泳仪工作示意图,11/15/2024,17,进样系统,静压力进样和电动进样,进样体积一般在纳升级,进样长度必须控制在毛细管总长度的,1%2%,，否则将影响分离效率,11/15/2024,18,分离系统,毛细管,:,由熔融石英制成,内径通常为,2575m,外径为,350400m,，,有效长度为,80100cm;,恒温系统,:,控制柱温变化在,0.1,0,C,；,高压电源,:,电流,0300A,电压,030KV,电压稳定性在,0.1%;,11/15/2024,19,back,11/15/2024,20,检测系统,常用的检测方式是,紫外,-,可见光吸收,.,检测器位于距样品盘约毛细管总长的,2/34/5,处,对毛细管壁内部分进行光聚焦；,此外，,荧光,，,激光诱导荧光,，,质谱,等检测方法也被应用于毛细管电泳,;,11/15/2024,21,高效毛细管电泳仪实图,11/15/2024,22,1,、,离子分析,analysis of ion,2,、,药物分析,analysis of pharmaceutics,3,、手性化合物分析,analysis of,chiral,compounds,4,、氨基酸分析,analysis of amino acids,5,、,核酸分析及,DNA,测序,analysis of nucleic acids and sequence of DNA,6,、新进展及热点问题,advances and special topics,五、高效毛细管电泳应用与进展,application and advances of HPCE,11/15/2024,23,1,、,离子分析,analysis of ion,阳离子分析,迁移方向和电渗流方向一致；,4.5min,内分离了,24,种金属离子；,阳极进样，阴极检测；,具有很高的灵敏度；,11/15/2024,24,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；,质量小、电荷密度大的离子如：,SO,4,2-,、,Cl,-,、,F,-,等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；,加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在,3.1min,内分离,36,种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；,毛细管区带电泳（,CZE,）；,11/15/2024,25,2,、药物分析,analysis of pharmaceutics,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；,尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；,采用毛细管区带电泳方式，在,11min,内分离,17,种药物；,11/15/2024,26,采用,MEKC,模式，鉴定违禁药物；效果优于,HPLG,法,毛细管电动力学色谱,(MEKC),11/15/2024,27,3,、手性化合物分析,analysis o