分子生物学实验-PCR-RFLP检测NQOC609T多态性-PPT

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学实验 PCR-RFLP检测NQOC609T多态性,（一）掌握盐析法快速,DNA,抽提法的原理。,（二）掌握,PCR-RFLP,分型,SNP,的原理。,（三）熟悉盐析法快速,DNA,抽提法的操作技术。,（四）了解单核苷酸多态性的常用分型方法。,【学习目的要求】,【实验教学内容】,（一）实验原理,（二）实验操作,是指群体基因组,DNA,特定的核苷酸位置上，,不同个体之间存在,2,种或,2,种以上不同碱基，,形,成,DNA,序列多态性，其中低频率的等位基因,在,群体中的频率不小于,1%,。,单核苷酸多态性,(single nucleotide polymorphisms,SNPs),，,（一）实验原理,SNPs,分类,调控区,SNPs,内含子区SNPs,编码区,SNPs,同义,SNPs,非同义,SNPs,单链构象多态性、,RFLP(restriction fragment length polymorphism,，限制性片段长度多态性,),，变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、单碱基延伸、高分辨率熔解曲线、,DNA,测序等，它们都是在对目的,SNP,扩增的基础上对,PCR,产物进行分析。,单核苷酸多态性的常用分型技术,PCR(polymerase chain reaction),聚合酶链式反应,PCR-RFLP,限制性片段长度多态性,RFLP(restriction fragment length polymorphism),大家应该也有点累了，稍作休息,大家有疑问的，可以询问和交流,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口：平端切口,、,粘端切口,GGATCC,CCTAGG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,NQO1,基因,C609T,（,rs1800566,）,NQO1,基因,C609T,（,rs1800566,）,NQO1,基因,C609T,（,rs1800566,）,本实验利用盐析法提取口腔拭子,DNA,，,PCR,扩增后用,Hin,f,酶切，琼脂糖凝胶电泳分析,NQO1,基因,C609T,多态性。,盐析法提取口腔拭子,DNA,是用细胞裂解液和蛋白酶,K,消化裂解口腔黏膜上皮细胞，使其释放,DNA,，然后用浓盐沉淀蛋白质并通过离心去除蛋白质，再用异丙醇沉淀,DNA,，最后经,70,乙醇洗涤后得到,DNA,。,盐析法,提取口腔拭子,DNA,1,、清水漱口，灭菌棉签擦拭颊粘膜,10,次。,2,、将拭子放入,1.5 ml,离心管中，加入裂解液,400 l,、蛋白酶,K,20 l,，搅动使拭子上口腔黏膜上皮细胞脱落，折断拭子（棉,花部分留在离心管中）。,3,、将离心管放入,65,恒温水浴箱,30 min,，期间摇动数次。,4,、取出离心管瞬时离心，加入,200 l 5M Nacl,，充分混匀。瞬,时离心，将离心管内液体尽量转移到新的离心管中。,15000rpm,5 min,，将上清转移到新的离心管中。,5,、加入等体积异丙醇，充分混匀。,15000 rpm5 min,，弃上,清。沉淀加,1.0 ml 70%,乙醇洗涤,1,次，,15000 rpm5 min,，,弃上清。,6,、瞬时离心，吸出管底乙醇，加入,DNA,溶解液,50 l,。,（二）实验操作,gnl|dbSNP|rs1800566|allelePos=501|totalLen=1001|taxid=9606|snpclass=1|alleles=C/T|mol=Genomic|build=147 AGTGGAAGCC GCAATGAGCC GAGATCGTGC CATGGCACTC CAGCCTGGAC GACCGAGCGA,GACTCTGCCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAGA AAAAGAAAAA AAGGACTCAT CTAGTTATAT,GGAGAGGCAG AGAAATGCAC CCACGCAGGT CTTGGTGAGT CACCTGCCAA GAAACTGAGA,CTCCCTAAAG TAACAGAACT TCCAGCCTTC TTGGCAAAGG ATCCAGGTTG GCACAGTTTC,AAGGTTTATG CATTTAAAGA AGAACACACC TGAGAAGGCT AAAATTGGTA ACGGCTAGGT,AGAGGGTAAG AGAGAGACGC TAGCTCTGAA CTGATTCTCT AGTGTGCCTG AGGCCTCCTT,ATCAGAGTGT CTTACTGAGA AGCCCAGACC AACTTCTGTT GTTTATAGTA CAACTGCATG,GAATTGGTTG ACTTACCTCT CTGTGCTTTC TGTATCCTCA GAGTGGCATT CTGCATTTCT,GTGGCTTCCA AGTCTTAGAA,Y,CTCAACTGAC ATATAGCATT GGGCACACTC CAGCAGACGC CCGAATTCAA ATCCTGGAAG,GATGGAAGAA ACGCCTGGAG AATATTTGGG ATGAGACACC ACTGTATTTT GCTCCAAGCA,GCCTCTTTGA CCTAAACTTC CAGGCAGGAT TCTTAATGAA AAAAGAGGTA CAGGATGAGG,AGAAAAACAA GAAATTTGGC CTTTCTGTGG GCCATCACTT GGGCAAGTCC ATCCCAACTG,ACAACCAGAT CAAAGCTAGA AAATGAGATT CCTTAGCCTG GATTTCCTTC TAACATGTTA,TCAAATCTGG GTATCTTTCC AGGCTTCCCT GACTTGCTTT AGTTTTTAAG ATTTGTGTTT,TTCTTTTTCC ACAAGGAATA AATGAGAGGG AATCGACTGT ATTCGTGCAT TTTTGGATCA,TTTTTAACTG ATTCTTATGA TTACTATCAT GGCATATAAC CAAAATCCGA CTGGGCTCAA,GAGGCCACTT AGGGAAAGAT,GAAGCCCAGACCAACTTCTGTTGTTTATAGTACAACTGCATGGAATTGGTTGACTTACCTCTCTGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGTGGCATTCTGCATTTCTGTGGCTTCCAAGTCTTA,GAAYC,TCAACTGACATATAGCATTGGGCACACTCCAGCAGACGCCCGAATTCAAATCCTGGAAGGATGGAAGAAACGCCTGGAGAATATTTGGGATGAGACACCACTGTATTTTGCTCCAAGCAGCCT,Y=C,或,T,PCR,扩增,反应体系（,20 l,）：,2Taq master mix 10.0 l,模板,1.0 l,引物（,F,R,）,0.8 l,灭菌去离子水,8.2 l,离心后放,PCR,仪扩增,(,注意盖子,),反应条件：,94 5min,94 20s,60 20s,72 20s,72 5min,2%,琼脂糖凝胶电泳,35,个循环,10FastDigest Green Buffer,1 l,PCR,产物,5 l,FastDigest,Hin,f,1 l,灭菌去离子水,9 l,混匀离心后,37,酶切,10min,酶切,GAAGCCCAGACCAACTTCTGTTGTTTATAGTACAACTGCATGGAATTGGTTGACTTACCTCTCTGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGTGGCATTCTGCATTTCTGTGGCTTCCAAGTCTTA,GAAYC,TCAACTGACATATAGCATTGGGCACACTCCAGCAGACGCCCGAATTCAAATCCTGGAAGGATGGAAGAAACGCCTGGAGAATATTTGGGATGAGACACCACTGTATTTTGCTCCAAGCAGCCT,Y=C,或,T,G ANTC,Hin,f,