细胞表面分子的检测与分析

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,本次实验课流程,课件讲述 40min,实验演示 20min,流式细胞仪硬件及软件介绍 30min,上机检测 40min,解惑答疑 15min,医学结构生物学研究中心,柳卫凰,细胞表面分子的检测与分析,流式在细胞表面分子检测中的应用,免疫细胞及其亚群的检测与功能分析,例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等,血液系统细胞表面标志的研究,例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、血小板分析辅助诊断相关疾病等,细胞群体及细胞表面标志变化的监测,例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化,细胞表面标志构成性质的分析,例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析,标本来源,外周血,全血溶血、PBMC,骨髓穿刺液,体液、灌洗液,实体组织,新鲜组织、石蜡包埋样本,培养的细胞,原代细胞,细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞,一、新鲜实体组织样本的制备,酶消化法。,常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等,机械法。,1,、剪碎法,2,、网搓法,3,、研磨法,化学处理法。,常用试剂：,0.2%EDTA 0.25%,胰酶,+0.2%EDTA,注意,：除消化过程外，其余步骤最好在,4,度环境下操作，提高 细胞活性。,标本制备,标本制备,二、全血标本的制备,“ABC”溶血（Beckman）,取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次,加入A液600ul，,轻轻振荡15s；B液260ul,轻轻振荡15s；,C液100ul,振荡10s，免洗上机检测。,“ACK”溶血（自配）,以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混,匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反,复23次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标,记。,标本制备,三、,外周血单个核细胞的制备,（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀；,（2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大；,（3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层,为分离液层，底层为红细胞层；,（4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水,洗两遍，PBS重悬；,（5）荧光标记。,四、贴壁细胞单细胞悬液的制备,（1）将培养细胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分钟，,至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化,液，加PBS；,（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；,（3）离心，1000r/min，5min；,（4）加PBS洗两遍；,（5）PBS重悬，将细胞吹打均匀；,（6）荧光标记。,标本制备,标记方法,直接免疫荧光法,特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。,间接免疫荧光法,特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断。,（,建议只用于单标检测）,直接、间接混合染色法,染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直,接标记。,推荐！,对照设置,阴性对照,调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。常用的有：,同型对照,、封闭抗体对照、阴性细胞对照,阳性对照,检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。,空白对照,确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。,补偿对照,多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。,同型对照（,Isotype Control,）,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色,与染色的单克隆抗体,相同种属来源,相同免疫球蛋白及亚型,相同荧光素标记,相同剂量和浓度,由未免疫动物血清纯化而来,双色标记荧光补偿,口诀：横平竖直,荧光补偿对照,分析类型,管,功能,加入的抗体,单色分析,1,Isotype,1-FITC,2,Sample1,2,A-FITC,双色分析,1,Isotype,1-FITC,2a-PE,2,Compensation1,A-FITC,2a-PE,3,Compensation2,1-FITC,B-PE,4,Sample1,2,A-FITC,B-PE,三色分析,1,Isotype,1-FITC,2a-PE,1-PC5,2,Compensation1,A-FITC,2a-PE,1-PC5,3,Compensation2,1-FITC,B-PE,1-PC5,4,Compensation3,1-FITC,2a-PE,C-PC5,5,Sample1,2,A-FITC,B-PE,C-PC5,四色分析,1,Isotype,1-FITC,2a-PE,1-ECD,1-PC5,2,Compensation1,A-FITC,2a-PE,1-ECD,1-PC5,3,Compensation2,1-FITC,B-PE,1-ECD,1-PC5,4,Compensation3,1-FITC,2a-PE,C-ECD,1-PC5,5,Compensation4,1-FITC,2a-PE,1-ECD,D-PC5,6,Sample1,2,A-FITC,B-PE,C-ECD,D-PC5,注意事项,样本的采集、储存,样本的染色,全血样本的溶血效果,流式实验对照的设置,样本的采集,手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血或组织坏 死。深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，造成检测结果的误差。,采集静脉血样本时，要避免发生溶血。,收集培养的细胞时，要注意选择消化的方法和试剂。,样本的储存,原则：时间越短越好,肝素抗凝的外周血和骨髓：室温,72小时,EDTA抗凝的标本：室温,24小时,ACD抗凝的外周血：室温,72小时,ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝,粒细胞、血小板功能检测：即刻检测,单核细胞表面抗原分析：1小时，4,嗜酸性粒细胞表面抗原分析：24小时，4,淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析：72小时,样本的染色,影响抗原抗体反应的因素,电解质、反应温度与时间、PH值（7.27.4）,流式抗体的选择,根据流式细胞仪的类型选择抗体,抗体应用级别、滴度和使用量的选择,根据抗原表达量选择抗体,溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶血过程进行严格控制。,全血样本：溶血效果很重要,影响溶血的因素：,采血过程,溶血剂的使用,实验操作过程,结语,流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准,最佳样本制备方法需要根据具体情况独立设定评估,常用的荧光染料,荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色,FITC 488 525 免疫荧光 绿色,PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色,ECD 488 620 免疫荧光 橙红,PeCy5 488 675 免疫荧光 红,PI 488 620 DNA染色 橙红,PECy7 488 755 免疫荧光 深红,PerCP 488 670 免疫荧光 深红,参考书籍,实用流式细胞术彩色图谱王书奎主编,流式细胞术基本原理与实用技术梁智辉主编,临床流式细胞分析 王建中主编,流式细胞术 杜立颖主编,实验：人外周血T淋巴细胞亚群的 检测与分析,淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成,这些细胞数量不等，甚至非常稀少,这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它们的基础,T淋巴细胞(CD3+),名 称,功 能,CD3+CD4+,辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti),辅助和诱导细胞免疫和体液免疫,CD3+CD4+CD29+,CD3+CD4+CD29-,辅助性T细胞(Th),诱导性T细胞(Ti),辅助细胞免疫和体液免疫,诱导细胞免疫和体液免疫,CD3+CD8+,抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc),抑制免疫反应/杀伤异源细胞,CD3+CD8+CD28-,CD3+CD4+CD29-,抑制性T细胞(Ts),杀伤性T细胞(Tc),抑制细胞和体液免疫,细胞毒性T细胞,CD3+CD4+CD8+,活化的T细胞,在T细胞恶性增生时升高,CD3+CD4-CD8-,有调节功能的T细胞,其表达,/,T细胞受体(TCR,/,),CD4+/CD8+比值,CD45RA+CD45RO-,幼稚的/静止的T淋巴细胞,当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低,CD45RA-CD45RO+,记忆性T淋巴细胞,病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低,CD45RA+CD45RO+,活化的T细胞,感染时升高,感染时升高,活化T淋巴细胞,名 称,功 能,CD3+HLA-DR+,活化T细胞,CD4+HLA-DR+,活化的辅助性/诱导性T细胞,CD8+HLA-DR+,活化的抑制性/杀伤性T细胞,CD4+CD25+,活化的辅助性/诱导性T细胞,CD8+CD25+,CD8+CD38+HLA-DR+,活化的抑制性/杀伤性T细胞,在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差,B淋巴细胞(19+),CD19+CD23+,活化的B细胞,过敏患者中升高,CD19+CD5+,在自身免疫性疾病中升高,CD19+CD5+CD23+,慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞,NK细胞,CD3-CD(16+56)+,自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高,CD3+CD57+,CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆,1.取新鲜抗凝血100ul，置于FCM测量管中；,2.直接标记法：加入带荧光标记抗人的单克隆抗体 10ul，充分混匀，4,闭光孵育2030min;,3.加入溶血剂A液600ul,轻轻振荡15s,加入溶血剂B液260ul,轻轻振荡15s，,加入溶血剂C液100ul,振荡10s,上机检测。,ACK溶血剂:,加入2mlACK,溶血剂,，充分混匀，反应5min,1000r/min离心5min，去上清；重复一遍，用PBS洗涤1遍，收集细胞上机检测。,实验步骤,ABC溶血剂配方,A:0.12%甲酸 (超纯水配置),B:碳酸钠 6.0g/L;氯化钠14.5 g/L;,硫酸钠 31.3g/L (超纯水配置),C:多聚甲醛 10.0g/L(PBS配置),ACK溶血剂配方,150mM(8.025g)NH4Cl,10mM(1.01g)KHCO3,0.1mM(0.0372g)Na2EDTA,调PH至，定容至1000ml,无菌滤膜滤过，4保存,实验分组,A:同型对照管或空白对照(,调节电压,),B:单标补偿管(,电压不变,调节荧光补偿,),C:双标样本检测管,荧光补偿,“,A,门”内,CD3/CD4,的表达,“,A,门”位置变化引起的改变,“,A,门”位置变化引起的改变,小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达,思考题、实验报告,1、同型对照、空白对照、补偿对照各有什么 意义？,2、多色荧光标记时如何设置对照？,3、样本处理过程中要注意哪些事项。,实验报告,：请根据你科研的需要设计一个完整的流式实验。内容包括：实验原理、材料与方法、实验步骤、实验结果等。,Thank you！,