细胞培养技术 第一章 绪论和基本理论

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞培养技术,1,第一章 绪论和根本理论知识第一节 绪论,一、体外培养In Vitro culture,1、概念：将活体结构成分甚或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在体外环境中，让其生长和发育的方法。,组织培养：组织多指组织块,2、结构成分：细胞培养：单个细胞或细胞群,器官培养：器官的原基、器官的,一局部或整个器官,2,第二节,生存环境、条件,一、无污染环境：首要条件,二、温度 36.50.53637,三、气体环境和氢离子溶度,95%空气+5%CO2 pH值为7.27.4,四、生存所需根本物质,一糖；二氨基酸；三促生长因子；四其它物质,五、渗透压：260 320 mOsm/kg 等渗,六、培养基：天然培养基和合成培养基,3,第二节 无菌操作设施和工作间,一、净化工作台super clean bench,测流式、直流式和外流式,二、无菌操作室：更衣间、缓冲间和操作间,三、清洗和准备区：洗涤间，洗刷、浸酸、,消毒、蒸馏水,五、温育和贮存区：温箱、冰箱、干热箱、液氮罐,六、观察区：摄影器材、倒置显微镜,第二章 设施和根本条件第一节 实验室设计,4,第三节,实验室设备,一、CO2培养箱：5%CO2，T 36.50.5,二、电热枯燥箱：烘干和干热消毒 60,三、冰箱：培养用的溶液，4、20和80,四、显微镜,五、水纯化装置,六、过滤除菌装置1 Zeiss滤器2玻璃漏斗式滤器3微孔滤膜滤器,5,七、细胞冷冻储存器：,液氮罐、80超低温冰箱,八、离心机、天平、电动吸液器和加样器,九、细胞计数板和电子细胞计数仪,十、pH计,十二、高压蒸汽消毒装置,十三、其它仪器,6,第四节 器械及培养器皿,常用的器械：手术剪、虹膜剪、镊子、止血钳等。,一、玻璃器皿：1玻璃瓶 2培养瓶 3培养皿 4吸管和吹打管 5离心管,二、塑料瓶皿：多孔培养板；培养皿；培养瓶；,7,第三章,培养用液,第一节 水和平衡盐溶液,一、水：二蒸水、三蒸水,二、BSS：Ringer液、PBS 液、D-Hanks,液和Hanks液,第二节 天然培养基血清,一、种类：人血清和动物血清牛、马、,猪、兔,二、血清中成分：蛋白质、多肽、激素和,其它成分。,8,第三节 合成培养基,三、使用前处理：,56水浴灭活30分钟,四、保存：,灭活的血清保存于4中；未灭,活的血清保存在-20冰箱中。,一、合成培养基的种类,1、MEM Engle培养液,2、DMEM：,高糖型和低糖型,3、RPMI 1640,4、M 199,9,二、合成培养液的配制,一培养液的制备,用干粉制备培养液的过程如下：,1制备去离子水玻璃三蒸水；,2加温水至1530；,3把干粉参加水中，搅拌令之溶解；,4加NaHCO3；,5加水至终量；,6必要时用1N HCl或1N NaOH调节pH；,7用0.22m或小于此微孔滤膜滤过消毒。,10,二培养液的种类,基本培养基 血清,生长培养液 8090%1020%,维持液,95%25%,第四节 其它溶液,一、消化液：胰蛋白酶溶液 0.25%或 0.125%；0.02%EDTAVersene溶液,11,二、pH调整液,1.NaCO3液：7.4%、5.6%、3.7%,2.HEPES分子量238.31液,三、抗生素液：青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素,第四章 清洗与消毒,一、玻璃器皿的清洗,一浸泡,二刷洗,三浸酸:24h,12,类,型,重铬酸钾 浓硫酸 蒸馏水,（,g,）（,ml,）,（,ml,）,强,液,63 1000 200,次强液,120 200 1000,弱,液,100 100 100,不同的强度清洗液,四冲洗,13,二、胶塞的清洗,三、塑料器皿的清洗,四、包装,1局部包装：较大的瓶皿、滤器，消毒筒等只把瓶口局部用硫酸纸包裹后，再罩以牛皮纸或棉布密包起来用线扎紧即可。,2全包装：比较小的培养皿、注射器、金属器械和胶塞等需采用全包装，现多包入铝饭盒。,14,第二节,消,毒,一、物理消毒法,1.射线消毒法：60Co、X射线和加速器,2.干热消毒法：160保持60分钟,3.湿热消毒高压蒸汽消毒：15磅20分钟,4.滤过消毒：Zeiss滤器、微孔滤膜器,二、化学消毒法：来苏儿、新洁尔灭、过氧乙,酸和75%酒精,三、抗生素消毒法,15,第五章 根本培养技术,第一节 组织培养的根本操作和培养技术,一、培养操作根本要领和要求,一无菌操作,1.操作野消毒：紫外线灯 3050分钟 工作台,2.洗手和着装：75%酒精,3.火焰消毒：酒精灯或煤气灯,二、根本培养操作技术,一组织的别离,16,1.离心别离法：全血淋巴细胞别离,2.机械别离法：切割别离法；机械别离法,3.消化别离法Tripsin：,1胰蛋白酶：0.25%浓度，多用于消化传代细胞,2弹性蛋白酶Elastase：消化纤维蛋白、弹性纤维,3胶原酶Collagenase：胶原纤维,4链霉蛋白酶EPronase E：,5EDTA消化液：0.02%，消化传代细胞,17,二细胞冻存和复苏,低温液氮冷冻贮存：-196,1.原理：10%的DMSO或甘油,2.要点：慢冻快融,3.冻存方法：1消化、离心细胞；,2计数；3冻存液；4分装,4.复苏方法：1取出细胞；2解冻,3离心；4分装培养,18,1筛选、消化、离心细胞：24小时前换液一次；,2计数：5106/ml,3冻存液：冻存液一滴滴参加离心管中，吹打令细胞重悬注意不要产生气泡,4分装：12ml/无菌冻存管,5封口：拧紧瓶盖，胶布封好口端，并写明细胞种类、时间、代数。,6冻存：4冰箱30min-20冰箱60min-80冰箱中24h以上至一周，然后可直接放入液氮罐。,19,1取出细胞：易爆炸，应保护好眼睛。,2解冻：3637水浴并不断摇动令细胞快速解冻-50,3离心：5001000转/分钟，510分钟，弃上清，加培养液制成细胞悬液,4分装培养：接种到25ml培养瓶内，CO2培养箱中培养。,20,第二节,原代培养和传代培养,一原代培养primary culture，初代培养,1.概念：是从供体获取组织后的首次培养。原代培养中“代并不是指细胞的“代数，原代培养培养物中的细胞在接种之后可能经过屡次细胞分裂活动而产生多个子细胞。,2.方法：消化法,贴块法explant culture,21,1.,消化法,1准备：紫外线消毒3060分钟,2处理组织：漂洗23次，去除血污,3剪切：23mm,5消化：消化液，37 CO2培养箱,6过筛：100微米的网筛除去小块组织和残渣,7离心、接种、培养：,22,2.贴块法explant culture,1剪切：1 mm3,2摆布：均匀摆布在培养瓶底 0.5cm,3干涸贴牢：CO2培养箱中12小时令组,织块贴牢,4培养：参加少许培养液注意不要把组,织块冲走，置CO2培养箱，待细胞从,组织块游出数量增多后，再补加培养液。,23,二传代培养passage,1.,贴壁依赖型细胞,2.悬浮培养细胞,24,1.贴壁依赖型细胞,1吸出旧培养液；,2润洗或初次消化：无菌PBS冲洗或用1ml胰蛋白酶润洗,3消化：1ml消化液 CO2培养箱15分钟细胞变圆，间隙增大终止消化；,4吸出消化液Hanks液冲洗；胰蛋白酶单独消化直接参加培养液；,5吹打：轻轻反复，勿用力过猛，防止产生气泡,6分装培养：,25,2.悬浮培养细胞,1转移到离心管：离心1000转/min，5分钟。,2吸出上清夜：给细胞沉淀参加培养液重新悬浮。,3接种：分别取局部细胞悬液，接种在数个培养瓶内。,4补加培养液。入培养箱内进行培养。,26,第六章,污染表现和判断,1.真菌污染：白色或浅黄色点漂浮于培养液外表，镜下观丝状、管状或树枝状菌丝,2.细菌污染：清澈透明浑浊；橙红色黄色 细胞生长迅速也会变为黄色,3.支原体污染：常来源于血清，0.22微米；使细胞增殖缓慢、局部细胞变圆、从瓶壁脱落。但多数细胞受污染后。无明显变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。,4.病毒污染：,27,参考文献,1,薛庆善,主编,.,体外培养的原理与技术,.,北京：科学出版社，,2001.2,2,鄂征,.,主编,.,组织培养和分子细胞学技术,.,北京：北京出版社，,1994.12,3,司徒镇强,.,细胞培养,.,西安：世界图书出版社公司西安分公司,.1996.,28,29,30,31,32,33,34,血管平滑肌细胞,35,HL60,36,