常见的生化和分子生物学技术 (2)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,常见的生化及分子生物学技术大串烧,南京大学 杨荣武,电泳,电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下，向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然，带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的,“,泳动,”,速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。,电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。,等电聚焦凝胶电泳、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。,电泳法分离三种不同的氨基酸,透析和超滤,透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子溶液中的小分子物质。,超滤 对透析原理进行了改进，它利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液的目的。,透析方法示意图,超滤方法示意图,沉淀与离心,沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。,实现选择性沉淀的方法有改变,pH,或改变离子强度或者加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。,离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作用下通过溶液发生沉降。,差速离心和密度梯度离心,层析,层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：一个是,固定相,，它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的,流动相,，如水和各种溶剂。当待分离样品随着流动相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到分离各组份的目的。,表,1,主要的层析方法及其原理,名称,分离原理,吸附层析,各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同,分配层析,各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同,离子交换层析,固定相是离子交换树脂，各组份因,所,带电荷状况不同与离子交换树脂的亲和力不同,凝胶层析,固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞的程度不同,疏水层析,固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂的结合能力不同,亲和层析,固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组份分离的目的,离子交换树脂分离氨基酸,分子筛示意图,亲和层析示意图,蛋白质研究方法,假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质,X,1.,如何得到这种蛋白质,?,蛋白质的分离、纯化技术,2.,这种蛋白质的大小？,（,SDS-PAGE,）,3.,它的,pI,是多少？,（等电聚焦）,4.,其他细胞或其他生物体内是否存在？,（,Western,印迹）,5.,其一级结构如何？,（序列分析）,6.,其三维结构又如何？,X-,射线衍射和核磁共振,蛋白质纯化,一、准备工作：要解决三个问题：,（,1,）纯化蛋白质的目的；,（,2,）目标蛋白的测活方法；,（,3,）纯化蛋白质的原料。,二、纯化步骤：,（,1,）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；,（,2,）去除残渣（离心）；,（,3,）沉淀,/,浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；,（,4,）纯化（层析）；,（,5,）鉴定,蛋白质和酶纯化的常见方法和方案设计,分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水性、与特定配体结合的性质等。,常用的方法有：沉淀（溶解性）；离子交换（电荷）；聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏水作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的特异性结合）。,蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先要解决三个问题：（,1,）纯化蛋白质的目的；（,2,）目标蛋白的测活方法；（,3,）纯化蛋白质的原料。,一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般经过四个阶段：（,1,）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（,2,）去除残渣（离心）；（,3,）沉淀,/,浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（,4,）纯化（层析）；（,4,）鉴定，包括纯度、大小或,pI,的测定。,蛋白质纯度的鉴定,（,1,）电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。如果使用,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应该特别小心，因为,SDS,能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白质由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳法检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧的两个不同的,pH,值分别进行检测，这样得出的结论才更可靠；,（,2,）化学法：,N-,端测定，,C-,端测定。纯品蛋白质应该具有恒定的,N-,端或,C-,端组成。如果一种蛋白质只有一条链组成，则只会检测到一种,N-,端或,C-,端氨基酸；,（,3,）仪器法：,HPLC,或质谱。如果一种蛋白质样品在,HPLC,上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量与实际的值一致，那么也可认为它是纯品。,等电聚焦,需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的,pH,梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其,pI,相当的,pH,位置上。于是通过,等电聚焦，不仅可以实现,pI,不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的,pI,蛋白质的双向电泳,蛋白质一级结构的测定,直接测定法,间接测定法：,先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。,表,2,各种印迹技术,印迹类型,转移到膜,上的分子,探针,获得的信息,Southern,DNA,片段,放射性标记的互补,RNA,或,DNA,基因结构等,Northern,RNA,放射性标记的互补,RNA,或,DNA,特定,RNA,的大小、分布和含量,Western,蛋白质,一级抗体和与酶偶联的二级抗体,特定蛋白质的大小、分布和含量,Western,印迹,基因芯片,基因芯片是随着,“,人类基因组计划,”,和其它模式生物基因组计划的进展而发展起来一门新技术，也叫,DNA,芯片、,DNA,微阵列或寡核苷酸阵列，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的,DNA,探针固定在支持物表面上，产生二维,DNA,探针阵列，然后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快速和准确地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新药开发等方面显示出巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的一大利器，因此，被誉为是基因功能研究领域最伟大的发明之一。,一般说来应用基因芯片分,5,步进行：（,1,）生物学问题的提出和芯片设计与制备；（,2,）样品制备；（,3,）生物杂交反应；（,4,）结果探测；（,5,）数据处理和建模。,使用基因芯片对正常细胞,和癌细胞进行基因表达分析比较,RNA,干扰（,RNAi,）,RNA,干扰是由双链引发的转录后基因沉默机制,miRNA,是指微,RNA,，其长度通常为,21nt25,nt,，由内源基因编码，前体含有不完善的发夹结构，能够识别多个目标，通常与目标,mRNA,的,3-UTR,结合，从而阻止它们的翻译，但并不导致目标,mRNA,的水解。,siRNA,是指短干扰,RNA,，长度也在,21nt25,nt,之间，但多数来自外源的双链,RNA,，作用方式通常为高度特异性的，与目标,mRNA,结合后，导致它们的降解。,RNAi,的作用机制,RNAi,的生物学意义,目前普遍认为，它在植物和昆虫体内相当于一种免疫系统，起着保卫基因组的作用，它能够防止外来的有害基因或病毒基因整合到植物基因组中，此外，它还参与基因表达的调控。,RNA,干扰技术的应用,miRNA,的产生和作用机制,siRNA,的产生和作用机制,哺乳动物成熟的红细胞内还有哪些代谢途径？,哺乳动物成熟的红细胞已经丧失了各种细胞器，因此，那些发生在特定细胞器内的或部分反应发生在特定细胞器内的代谢途径也就不复存在。例如，发生在线粒体内的,TCA,循环、氧化磷酸化和脂肪酸氧化，发生在细胞核内的,DNA,复制、,DNA,转录及其后加工，部分反应发生在内质网的糖异生、发生在内质网上的磷脂合成。被保留的代谢途径主要是对红细胞的功能所必需的两条代谢途径：一条是糖酵解，另外一条是,PPP,。糖酵解是它获取,ATP,的唯一手段，通过乳酸发酵维持,NAD,+,的再生，而产生的乳酸通过乳酸循环在肝细胞内重新转变成葡萄糖。,PPP,是维持其细胞膜的完整性和血红蛋白的血红素铁处于二价态所必需的。,如何计算,ATP,的得失？,细胞内许多代谢途径伴随着,ATP,的消耗或合成。计算一种物质在特殊的条件下的合成或分解能产生或消耗多少,ATP,已成为许多考试的焦点（例如,1,分子葡萄糖在破伤风杆菌氧化最多能产生多少,ATP,或,1,分子葡萄糖在含有大量的砷酸的红细胞内产生多少,ATP,？）。遇到这样的问题，实际上只要全面考虑就行了，需要考虑以下几点：（,1,）有没有或有多少消耗,ATP,或其他能量货币的反应？注意其他能量货币与,ATP,是等价的，另外还要注意,ATP,是怎样被消耗的，即,ATP,变成,ADP,，还是变成,AMP,？如果是后者，要当成消耗,2,个,ATP,才行；（,2,）有多少产生,ATP,或其他能量货币的反应？注意,ATP,合成有底物水平的磷酸化和氧化磷酸化。在考虑氧化磷酸化的时候，要记住线粒体内的,1,分子,NADH,或,FADH2,进入呼吸链分别产生,2.5,个和,1.5,个,ATP,。至于细胞液内产生的,NADH,如何进入呼吸链取决于它通过何种穿梭系统进入？如果是甘油,-3-,磷酸脱氢酶穿梭系统，是产生,1.5,个,ATP,，否则是产生,2.5,个,ATP,；（,3,）反应系统之中有无干扰,ATP,产生的化学试剂，例如有无解偶联剂（砷酸或,DNP,）或呼吸链的抑制剂；（,4,）反应系统有氧还是无氧？如果有氧要考虑氧化磷酸化，无氧只要考虑底物水平的磷酸化。,对于,1,分子葡萄糖在破伤风杆菌氧化最多能产生多少,ATP,的问题，首先需要想到破伤风杆菌是一种厌氧菌，它只能通过糖酵解产生,ATP,，因此产生的,ATP,数目是,2,个。至于,1,分子葡萄糖在含有大量的