食品中铜绿假单胞菌检测课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,铜绿假单胞菌,一、概 述,铜绿假单胞菌（,P.aeruginosa,）俗称,绿脓杆菌,，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。,铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖，生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。,铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大霉素、多粘菌素,B,和羧苄青霉素。,铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强，,561h,可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗,力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大。,二、生物学特性,1.,培养特性,本菌属于假单胞菌属，是一种,非发酵,革兰阴性,无芽孢杆菌，菌体,细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或,短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显,微镜或相差显微镜下观察可见细菌,运动活泼,。,2,菌体形态,无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为,0.5,1m1.5,3.0m,，菌体笔直或弯曲。,3,、生化特性,氧化酶和过氧化氢酶阳性。,O/F,试验为氧化型，还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。,98,菌株产生,水溶性荧光色素,。铜绿假单胞菌能液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。,90,以上的菌株产生蓝绿色色素。,分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不产硫化氢。,三、致病性,主要致病物质是,内毒素,，此外尚有菌毛、荚膜、胞外,酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症,，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内,膜炎、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严,重的流行性腹泻。,WHO,的,HACCP,评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装,饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗,力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶,装水很可能导致疾病的发生，患者食入,10,3,10,4,个菌体细,胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸,盐的含量,-,参考文献,。,国内外污染情况,-,参考文献,国内污染情况：,-,瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率,1.2,23.6,；,-,瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率,11.6,。,国外污染情况：,-Richards,等在,104,件检品中的,4,件分离到铜绿假单胞菌；,-Rosenberg,报告德国,1.2,10.2,的瓶装矿泉水检出铜,绿假单胞菌。,刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报,道,5,加仑桶装产品（,15,31,天的保存期），铜绿假单胞,菌可生长繁殖达到,CFU/ml,。,国内卫生标准：,0 CFU/250ml,三、实验室检验,GB/T 8538-2008,铜绿假单胞菌检测（滤膜法）,原 理,将,250mL,水样用孔径为,0.45m,的滤膜过滤，,并将滤膜移至,CN,琼脂培养基上，于,36,士,1,恒,温箱中培养,48h,，能够在,CN,琼脂上生长并产生绿,脓菌素，或者能够在,CN,琼脂上生长并且氧化酶呈,阳性、紫外光（,36020nm,）照射下能发荧光、,能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，,经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。,培养基和试剂,假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（,低温避,光,保存）,金氏B,培养基（低温,避光,保存）,乙酰胺肉汤,营养琼脂,氧化酶试剂,钠氏试剂（配制好之后低温,避光,保存）,设备和仪器,玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需,121,高压蒸汽灭菌,15,分钟,恒温培养箱：,361,紫外灯：波长应为,36020nm,滤膜：直径,47mm,，微孔径为,0.45,（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌,3,次，每次,15 min,。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤,2,次,3,次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。）,显微镜：,10,100,冰箱：,0,8,操作步骤,-,水样过滤,在100级的洁净工作台进行过滤操作。,首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，,将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，,固定好滤器，将,250mL,水样或稀释液通,过孔径,0.45m,的滤膜过滤，然后将过滤,后的滤膜贴在已制备好的,CN琼脂平板,上，,平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着,气泡。,结果观察,培养20h24h观察滤膜上菌落的生长,情况并计数，,防止,因为培养导致菌落过分,生长而出现,菌落融合,。（40h48h时更,容易观察产色素情况和荧光情况）,。,可疑菌落计数情况,计数所有显,蓝色或绿色（绿脓色素）,的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。,计数滤膜上所有,发荧光不产绿脓色素,疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。,（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）,将其它所有,红褐色不发荧光,的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏,B,培养基确证实验。,纯 化,营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接,种营养琼脂培养基，于,361,培养,20h,24h,，对可疑菌进行纯化。,将最初显红褐色的菌落进行,氧化酶试验,氧化酶试验：,原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素,C,氧化，再由氧化型细胞色素,C,使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。,操作：取,2,3,滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在,10,秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。,产氨实验（,乙酰胺肉汤,）,原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加,钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。,操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在361下培养20h24h。然后向每支试管培养物加入12滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从,深黄色到砖红色,的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。,产荧光素实验（,金氏,B,培养基）,原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。,操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏,B,培养基上，于,361,恒温箱培养,24h,5d,。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将,5d,内产生荧光的菌落记录为阳性。,计数结果说明,菌落计数公式：,N,P,F(cF/nF),R(cR/nR),P,是呈蓝,/,绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。,F,是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。,R,是呈红褐色的菌落数。,nF,是进行产氨测试的显荧光菌落数。,cF,是产氨阳性的显荧光菌落数。,nR,是进行产氨、氧化酶、金氏,B,培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。,cR,是产氨、氧化酶、金氏,B,培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。,举 例,N=17+16(2/,5,)+10(3/,5,),17,：呈蓝,/,绿色的菌落数；,16,：没有绿脓色素但显荧光的菌落数；,2,：产氨阳性的显荧光菌落数；,5,：进行产氨测试的显荧光菌落数；,10,：呈红褐色的菌落数；,3,：产氨、氧化酶、金氏,B,培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数；,5,：进行产氨、氧化酶、金氏,B,培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。,样品稀释,若样品污染严重，建议对样品进行稀,释，如,10,倍递增稀释：取,30ml,样液加入,至,270ml,无菌生理盐水中，混匀，以此类,推，进行系列稀释。,报 告,结果以,CFU/250ml,计。,其他确证试验方法,自动生化鉴定仪器,生化试剂条（以国标法为参照，二者符,合率,99.6,-,参考文献,）,谢谢大家,