检验技术化学发光和荧光免疫技术及仪器

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第十一章,化学发光和荧光免疫技术及仪器,1,第一节 化学发光免疫分析技术,第二节电化学发光免疫分析,第三节时间分辨荧光免疫分析法,第四节荧光偏振免疫分析法,第五节化学发光免疫分析的临床应用,内容概述,:,2,教学目标和要求,掌握,化学发光免疫分析技术的基本原理、反应的底物和标记方法以及反应类型,。,熟悉,电化学发光免疫分析的基本原理和标记物，时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯合物,。,了解,荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点,，,化学发光免疫分析的临床应用,3,第一节 化学发光免疫分析技术,基本原理,反应的底物,标记方法,反应类型,相关仪器,4,一、基本原理,化学发光，,是指伴随化学反应过程所产生的发光的发射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使,反应物分子,形成电子激发态，当电子从激发态返回到稳定的基态时，多余的能量就以光子的形式发射出来。这一现象称为化学发光。,A +B C*+D,C*C +,h,5,(,一,),产生化学发光反应的条件和过程,化学发光与荧光的区别,:,化学能 光能,化学发光反应的条件,:,反应必须提供,足够的激发能,焓变,(H),介于,170,300 kjmol-1,之间，才能在可见光范围观察到化学发光现象,吸收了化学能后,处于激发态的分子或原子，必须以光子形式将能量释放出来,，或者,将能量转移到另一种物质的分子上并使该分子激发,，当被激发的分子回到基态时，也以光子的形式释放能量,6,(,二,),化学发光效率,化学发光反应的发光效率,(,Cl,),又称为化学发光总能量的产生率,Cl,取决于生成激发态产物分子的化学激发效率,(,CE,),和激发态产物分子的发射效率,(,EM,),。,一般化学发光反应，,Cl,值约为,10,-6,7,(,三,),强度与反应物质浓度之间的关系,反应物的浓度,反应速度,化学发光反应所发出的光的强度,8,(,四,),化学发光的反应类型,直接化学发光 间接化学发光,1,直接化学发光,化学反应释放的化学能激发的是反应产物分子,A +B C*+D,C*C +,h,9,2,间接化学发光,(,敏化的化学发光,),在化学反应中，激发能传递到另一个未参加化学反应的分子上，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子返回到基态时发光；或反应首先生成一种高能量的中间体，此中间体再将能量转移给另一个未参加化学反应的分子，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子跃迁回到基态时发光的过程。,A +B C*+D,C*+F F*+E,F*F+h,10,二、反应的底物,(,发光剂或发光底物,),在化学发光反应中，参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物,发光免疫技术中常用的化学发光底物,:,氨基苯二酰肼类,主要有鲁米诺,(3-,氨基苯二甲酰肼，,luminol,),和异鲁米诺,(5-,氨基苯二甲酰肼，,iso,lumino1),及其衍生物。,2,眯唑类化合物,较常用的是,2,，,4,，,6-,三苯基咪唑，即洛粉碱,(,lophine,),。,3,吖啶酯类,典型代表是,N,，,N-,二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精,(1ucigenin),。,4,苯酚类化合物,其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。,5,芳香草酸酯类,主要有双,-(2,，,4,，,6,，,-,三氯苯基,)-,草酸酯,(TCPO),和双,-(2,，,4-,二硝基苯基,)-,草酸酯,(DNPO),。,6,(,金刚烷,)-1,，,2-,二氧乙烷及其衍生物,11,12,三、标记方法,化学标记,生物标记,化学标记,:,用于化学发光,(,酶,),免疫测定,直接用,发光物质,(,如鲁米诺、吖啶酯类等,),标记,抗体或抗原,以,催化剂,(,如,HRP,、,GOD,等,),和或协同因子,(,如,ATP,、,NAD,等,),标记,抗体或抗原,按照标记物的应用,:,13,按照被标记物的结构或性质,:,对小分子物质,(,如甾体激素、药物等,),的标记,对大分子抗原、抗体的标记,(,如蛋白质、核酸等,),以及对某些配基和载体的标记,14,按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点,:,直接偶联,间接偶联,通过偶联反应，使标记物分子中的反应基团直接连接在被标记分子的反应基团上。,在标记物与被标记物之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过这种引入的“桥”连结成结合物,碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法和混合酸酐法,琥珀酰亚胺活化法、,O-(,羧甲基,),羟胺法、异硫氰酸酯衍生物和戊二醛法,15,16,常用的标记方法,1,碳二亚胺（,EDC,）缩合法,此法可用于蛋白质分子中的游离羧基或游离氨基的标记。常用的缩合剂有,l-,乙基,-3-(3-,二甲氨基丙基,)-,碳二亚胺,(EDC),和二环己基碳二亚胺,(DCC),直接偶联,17,2,重氮盐偶联法,(,又称重氮化法,),此法简易、成本低、重复性好，但不适用于脂肪伯胺基发光剂，因其生成的重氮盐不稳定，即使在,也会生成氮气。此外，,ABEI,等伯胺基位于侧链者也不适用此法。,芳香伯胺,直接偶联,18,3,过碘酸盐氧化法,标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫学活性的蛋白质。,直接偶联,19,4,戊二醛法,间接偶联,芳香伯胺基,氨基,由于戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后者占多数，所以在标记反应中双方分子间构成较大的距离，减少了在抗原抗体反应时的空间位阻；但因偶联不易定量控制且缺乏特异性等而未得到广泛应用,双功能偶联剂,20,5,琥珀酸酐法,(,环内酸酐法,),间接偶联,此法没有双功能交联剂的不良反应，能实现标记物和蛋白质分子间的单向定量缩合，标记效率高，已有商品化试剂供应。,21,6,异硫氰酸酯衍生物法,此法标记温和、稳定，获得的标记物不易脱落，且不损失蛋白质等的生物活性,发光标记物,标记物,间接偶联,22,7,O-(,羧甲基,),羟胺法,O-,羧甲基衍生物,8,混合酸酐法,23,四、反应类型,化学发光免疫分析,化学发光酶免疫分析,微粒子化学发光免疫分析,根据发光免疫分析中发光反应的不同体系和标记方法不同,24,1.,化学发光免疫分析,(,chemiluminescence,immunoassay,，,CLIA),用,化学发光剂直接标记抗原或抗体,免疫反应后生成标记的免疫复合物,通过启动发光试剂,(NaOH-H,2,O,2,),作用于,AE,而发光，发光强度依赖于免疫反应物中化学发光剂的浓度。,原理,:,常用化学发光剂,:,吖啶酯,(,acridinium,ester,，,AE),类化合物,反应特点,:,CLIA,检测小分子抗原采用竞争法；大分子抗原则采用夹心法。与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。,强烈的直接发光在,1 s,内完成，为快速的闪烁发光。,应用,:,25,1),直接化学发光使用吖啶酯,(AE),作为标记物，无需附加催化剂,。,AE,氧化直接发光，氧化反应在,430 nm,处快速发光并在,1s,内达到峰值。发光强度是,I,125,在,1min,内发光强度的十万倍，因此系统该具有高速度、产光强等特点。,2)AE,有甲基，增加了试剂的稳定性,，使试剂的稳定性好，有效期更长。,3)AE,作为化学发光标记物，,对温度及,pH,等外界环境的变化不敏感，,故其具有很高的精密度。,4)AE,相对分子质量水常小,(MW,：,481),，使其对结合反应的空间位阻作用减少，增加扩散率，提高了灵敏度，可达,l0-15molL-1,。,5)AE,是以共价键结合抗体,而不影响抗体结合抗原的反应，故不影响发光。,6)AE,加碱后，发光是在一暗盒中进行，其光量值与浓度有着良好的线性关系，且,本底较低,。,吖啶酯的特点,26,2,化学发光酶免疫分析,(,chemiluminescent,enzyme,immnunoassay,，,CLEIA),采用,参与发光效应的酶,作为标记物标记抗体或抗原，免疫反应后形成酶标记抗原抗体复合物，利用鲁米诺作为发光底物在酶和启动发光试剂,(NaOH-H,2,O,2,),的催化下，产生发光反应，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。,原理,:,底物 产物 发光,Ag+,Ab,*Ag-,Ab,*,*,27,常用标记物,:,辣根过氧化物酶,(HRP),或,ALP,反应特点,:,标记物常标记抗体；,标记物作为发光反应的催化剂，本身不发光,。,28,3,微粒子化学发光免疫分析,(,microparticle,chemiluminescence,immunoassay,，,MLIA),以,顺磁性微粒作为载体包被抗体,，利用磁性微粒能被磁场吸引，在磁力的作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到被测抗原。,加入,碱性磷酸酶标记的第二抗体,，形成磁性微粒包被抗体,-,抗原,-,酶标记抗体复合物,经洗涤去掉未结合的抗体后，,加入,ALP,的发光底物,AMPDD,，,AMPDD,被复合物上,ALP,催化发光,发射光所释放的光子能量被光量子阅读系统记录，通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度。,原理,:,29,AMPDD,一侧的芳香基团上的磷酸酯被水解，失去一个磷酸基而生成一个中等稳定的中间体,AMPPD(,半衰期,2,30min),，此中间体通过内部电子转移而裂解为一分子的金刚烷酮和一分子激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出波长为,470 nm,的光,),30,常用标记物,:,A L P,反应特点,:,可采用竞争法和夹心法,多采用双抗体夹心法,采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为标记物，固相载体的应用扩大了测定的范围,检测水平可茯,PgmL-1,，重复性好。,31,五、相关仪器介绍,ADVIA CENTAUR,全自动免疫分析仪,32,(,一,)ADVIA CENTAUR,检测原理,利用,化学发光,和,磁性微粒子分离技术,相结合的测定方法，用,高敏感性的吖啶酯作为化学发光标记物,，以,极细的磁性颗粒,(PMP),作为固相载体,，提供最大的包被面积。,1,液相吖啶酯,(AE),。,2,固相 氧化铁,(Fe,2,O,3,),。,包被面积大,减少了扩散时间,增加了捕获效率,33,(,二,)ADVIA CENTAUR,的反应类型,1,双抗体夹心法,34,2,竞争法 包括,AE,标记抗原法和,AE,标记抗体法。,35,3,捕获法,常用来检测样本中的特异性抗体，又称为抗体捕获法。,试剂中使用了一种,抗人免疫球蛋白的抗体,。抗体捕获法通常使用,两次温育和洗涤,，第一次温育和洗涤是为了除去样品中过多的干扰物质；第二次温育和洗涤是为了检测样品中的抗体。,36,第二节电化学发光免疫分析,电化学发光,(,electrochemiluminescence,，,ECL),是对电极施加一定电压进行的电化学反应，反应的产物之间或体系中某种组分发生化学发光，用普通化学手段测量发光光谱及强度从而对物质进行痕量分析的一种方法。,电化学发光免疫分析,(,electrochemiluminescence,immunoassay,，,ECLIA),是将,ECL,和免疫反应,(,抗原抗体反应,),融为一体,的标记免疫分析技术,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,.,37,一、基本原理,38,技术特点,1,ECLIA,为非核素方法,，可避免核素的放射性污染,2,为均相免疫测定技术,，检测中不需要分离结合相和游离相，操作简便,3,磁性微珠包被技术的应用,使检测的灵敏度更高、线性范围更宽、反应时间更短。,4,标记物,Ru,稳定性好，室温下半衰期大于,1,年，所标记的蛋白活性在,2,4,也可保持,1,年：以上。,5,标记物可进行化学修饰,，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子结合的活性,