实时荧光定量PCR原理课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量技术的应用,讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量,实时荧光定量,PCR,定义,在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积,实时监测,整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团,实时荧光定量,PCR,原理 实时原理,常 规,PCR,技术：,对,PCR,扩增反应的,终点产物,进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量,PCR,技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值,和标准曲线的分析对,起始模板,进行,定量分析,实时荧光定量PCR 原理,实时荧光定量,PCR,原理定量原理,介绍三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,如何对起始模板定量？,通过,Ct,值和标准曲线对,起始模板,进行定量分析,实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：如何对起始模板定,实时荧光定量,PCR,原理,-,扩增曲线,扩增曲线图：,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）；,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,实时荧光定量PCR 原理-扩增曲线扩,实时荧光定量,PCR,原理,-,荧光阈值,荧光信号阈值（,threshold,）,：,前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,），即,样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,荧光域值的缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍,手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入,指数,期的最初阶段，并且保证回归系数大于,0.99,真正的信号,:,荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值荧光信号阈,实时荧光定量,PCR,原理,-,Ct,值,Ct,值的定义,：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数,C(t)value,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定义,实时荧光定量,PCR,原理,-,Ct,值的重现性,横轴：,PCR,反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性横轴,实时荧光定量,PCR,原理,-,定量原理,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2,n,非理想的,PCR,反应：,X=X,0,(1+Ex),n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 -定量原理理想,实时荧光定量,PCR,原理,-,标准曲线,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小,Log,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,实时荧光定量PCR 原理 -标准曲线,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,Sample,实时荧光定量,PCR,原理 绝对定量,25,确定未知样品的 C(t)值 Sample实时荧光定量PCR原,讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量,非特异性荧光标记：,1,、,SYBR Green,特异性荧光标记：,2,、,TaqMan,3,、,Molecular Beacon,实时荧光定量,PCR,原理,-DNA,产物的荧光标记,非特异性荧光标记：实时荧光定量PCR 原理 -,实时荧光定量,PCR,方法,1-,SYBR Green,法,SYBR Green,实时荧光定量PCR 方法 1-SYBR G,SYBR Green,法 工作机理,SYBR Green,能结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green 法,实时荧光定量,PCR,原理,SYBR Green I,工作原理,5,3,5,3,SG,No Emission,SG,SG,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,Emission,Excitation,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工,实时荧光定量,PCR,原理,SYBR Green I,熔解曲线分析,温度,荧光强度,Tm,Tm,值：,DNA,解链一半时的温度,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔,实时荧光定量,PCR,原理,SYBR Green I,熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。,(-dI/dT),-dI,dT,T,m,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔,SYBR Green,法 融解曲线分析,融解曲线分析，单一峰,无非特异性荧光,定量准确,融解曲线分析，出现杂峰,其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确,非特异性产物,SYBR Green 法,Cycle number,Flourescenc,Ck 10,2,Ck 10,4,Sample,Cycle number,Log of DNA concentration,SYBR Green,法 定量原理,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少,Log,浓度与循环数呈线性关系，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,Cycle numberFlourescenc Ck 102,SYBR Green,法,-PCR,反应的建立,反应体系的建立及优化,:,SYBR Green,使用浓度,:,太高抑制,Taq,酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测,Primer,：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准,MgCl,2,的浓度,:,可以降低到,1.5mM,以减少非特异性产物,反应,Buffer,体系的优化,反应温度和时间参数,:,由酶和引物决定,其他与常规,PCR,相同,SYBR Green 法 -PC,SYBR Green,法 应用范围,起始模板的测定,基因型的分析,融解曲线分析：可以优化,PCR,反应的条件，对常规,PCR,有指导意义，如对,primer,的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法,SYBR Green,法 优缺点,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,优 点,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性,但可以通过,融解曲线的分析,，优化反应条件,对引物特异性要求较高,缺 点,SYBR Green 法,与目标序列互补,实时荧光定量,PCR,方法,2-TaqMan,法,TaqMan-,水解型杂交探针,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,与目标序列互补实时荧光定量PCR 方法2-Ta,TaqMan,法 工作原理,每扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan法,TaqMan,法,PCR,反应的建立,1,、引物、探针的设计：,探针,Tm,为,68-70,，,30 bp,5,不能有,G,，,G,可能会淬灭荧光素，,引物尽量靠近探针，扩增片段,400 bp,，引物,Tm,为,59-60,2,、反应参数的确定：,一般为：,94,，,10-20S,60,，,30-60S,（,Taq,酶,53,外切核酸酶活性在,60,最高）,也可通过温度梯度优化退火温度,72,，,45 S,，,3,、优化引物和探针浓度：获得最小,Ct,值，信号,/,背景比值的最大值,引物浓度：,50-900nM,探针浓度：,50-250nM,4,、其他与常规,PCR,相同,TaqMan 法,TaqMan,法 优缺点,对目标序列的高特异性,-,阴性结果确定,设计相对简单,-,与目标序列某一区域互补,重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,TaqMan法,实时荧光定量,PCR,方法,3-Molecular beacon,法,(,分子信标,),标记荧光的发夹探针,环与目标序列互补,茎由互补配对序列组成,环,茎,荧光素 淬灭剂,发夹型杂交探针,实时荧光定量PCR 方法 3-Molecula,Molecular beacon(,分子信标,),工作原理,荧光共振能量转移（,FRET,）,探针与,DNA,杂交时产生荧光,-,变性过程：产生非特异性荧光,-,延伸过程：不产生荧光,-,退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon(分子信标)工,Molecular beacon(,分子信标,),应用范围,起始模板的定量,基因型分析,产物鉴定,SNP,（单核苷酸多态性）分析,Molecular beacon(分子信标),Molecular beacon(,分子信标,),优缺点,高特异性：,对目标序列,检测,SNP,最灵敏的试剂之一,荧光背景低,优 点,只能用于一个特定目标,设计困难,价格比较高,缺 点,Molecular beacon(分子信标),讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量,实时荧光定量,PCR,法 标准样品,相对定量中的内标,内标通常是,-actin,、,GAPDH,基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品：,已知拷贝数的质粒,DNA,实时荧光定量PCR法,实时荧光定量,PCR,法,标准样品,DNA,拷贝数,用于生成标准曲线的样品如何设定？,含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒,含有和待测样品相同扩增片段的,cDNA,紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度,根据质粒或,cDNA,分子量换算成拷贝数，做系列稀释,实时荧光定量PCR法 标准样品DNA拷贝数 用,实时荧光定量,PCR,法 定量方法,绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线,相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）,实时荧光定量PCR法,实时荧光定量,PCR,法 绝对定量方法,实时荧光定量PCR法,实时荧光定量,PCR,法,TaqMan,法举例,TaqMan,法研究,ERBB2,在乳腺肿瘤,组织标本中的表达差异,实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例,TaqMan,法举例 标记探针,使用,TaqMan,探针进行双通道荧光定量,Fam,标记目标基因探针,VIC,标记看家基因探针,TaqMan法举例,TaqMan,法举例 材料准备,从正常乳腺组织中提取的,总,RNA,从乳腺癌组织中提取的,总,RNA,含,ERBB2