05实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/9/14,#,实验五,DNA限制性,酶切,和琼脂糖凝胶,电泳,限制性内切酶,EcoR I Restriction Enzyme,识别序列：,-,G,AATT C,-,-,C TTAA,G,-,BamH I Restriction Enzyme,识别序列：,-,G,GATC C,-,-,C CTAG,G,-,Hind III Restriction Enzyme,识别序列：,-,A,AGCT T,-,-,T TCGA,A,-,每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：,pH范围：7.58.0,缓冲液组份:,Tris(三羟甲基氨基甲烷）、,NaCl、,MgCl,2,、,巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇）,温育温度：37,反应体系：,DNA (1ug或更少)5ul,10 x Buffer 2ul,Restriction Enzyme 3ul,H,2,O,10ul,Total 20ul,混匀，37度保温30分钟,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳,是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。,电 泳,在一个电场的作用下，在某种支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。,电泳法的优点,凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。,样品用量少。,设备简单。,可在室温进行。,操作简便，费时不多,不同类型的电泳，有不同的用途。,改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。,琼脂糖,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,琼脂糖浓度(%),线型DNA分子的分离范围(Kb),0.3,560,0.6,120,0.7,0.810,0.9,0.57,1.2,0.96,1.5,0.23,12.0,0.12,试剂,TBE电泳缓冲液,45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0,加样缓冲液,0.25%溴酚蓝，40%蔗糖,EB（溴化乙锭）染色液（有毒）,1ug/ml，用1TBE配制,Blue/Orange 6 x Loading Dye,组成,10%Ficoll 400,0.25%bromophenol blue（深蓝色）,0.25%xylene cyanlo FF（天蓝色）,0.4%orange G（黄色）,10mol/L Tirs-HCl(pH7.5),50mol/L EDTA,使用量,5份DNA溶液加1份Blue/Orange 6xLoading Dye,溴化乙锭(ethidium bromide，EB),EB,是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。,在电泳后，将凝胶浸入浓度为 0.5ug/ml的,EB,溶液中染色1015min。琼脂糖凝胶经,EB,染色后，在紫外光照射下，可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。,操作步骤,酶切反应,反应体系：,DNA,5ul,10 x Buffer 2ul,Hind III 3ul,H,2,O,10ul,Total 20ul,混匀，37度保温30分钟,电泳前的准备工作,准备内容,作用,1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，用蒸馏水洗净晾干,防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。,2.检查电泳槽，根据情况决定是否更换buffer。,排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。,3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录,达到较好的分离效果,4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录。,实验记录备查,制胶,步骤,注意事项,1.称量agarose和加入buffer,Buffer不要用成蒸馏水，称量相对准确,2.融胶。加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀。,小心烫手，注意不要加热过度使胶冲出瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。,3.封边和倒胶。使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，先用少量的凝胶封边，再沿着制胶板的一侧，缓缓地将凝胶一次性倒入。,制胶的桌面相对水平。,4.室温凝胶30分钟,过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。,5.拔梳子，放入电泳槽。,缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶至少1mm。,上样和电泳,步骤,注意事项,1.,样品中加入,loading buffer,使其终浓度为,1 X,，混匀,Loading buffer,浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。,2.,点样,匀速加入。避免碰坏胶孔。枪头不要吸气泡，拔起时不要猛带出样品。每点一个样完，吸取,buffer,洗枪头，避免样品混杂。加样的速度在保证质量的前提下越快越好。点样的量不要太大，点样量过大不仅容易溢出污染邻位样品，而且容易导致DNA条带脱尾和模糊不清。,3.,接通电源，选择合适的电压和时间电泳。,胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。经常检查，防止样品跑出胶等意外发生。,染色和成像,步骤,注意事项,1.染色,用0.5ug/ml的EB溶液浸染1015分钟。,2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像,3.保存或打印照片做分析记录,点 样,在DNA样品中加入 Loading Dye混匀。,Sample 1：取自提DNA,5ul,+2ul,Loading Dye,Sample 2:-DNA/,Hind III,20ul,+4ul,Loading Dye,用加样器吸取样品点入点样孔：,Sample 1：,7,ul,Sample 2:,1,5ul,9 8 7 6 5 4 3 2 1,9 8 7 6 5 4 3 2 1,点样前先安排好各点样孔的样品，做好纪录，然后依次从,右下角,开始按顺序点样。,提 示,电 泳,接通电源，200v恒压电泳1小时。,染色和观察,切断电源，取出胶模，将凝胶置入EB染色液中染色10-15分钟。,取出凝胶，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。,警告,胶染色和观察时一定要带手套！,EB（溴化乙锭）诱变！,1 2 3 4,RNA,提 示,将凝胶旋转180,o,，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。,1,自提DNA,2,-DNA/Hind III,3,-DNA,结果记录与分析,绘制电泳图谱,-DNA/,Hind III,Markers,-DNA/Hind III Markers 是利用EcoR I 彻底降解-DNA 后再进行内切酶的灭活处理和乙醇沉淀制备的。,贮藏缓冲液：,10mmol/L Tris-HCl(pH7.5),10mol/L NaCl,1mol/L EDTA,提问与解答环节,Questions And,Answers,谢谢聆听,学习,就是,为了达到一定目的而努力去干,是,为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和,挫折,Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard,Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal,