变性蛋白的复性课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,包含体是无定形的蛋白质的聚集不被,任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗,粒状致密低速离心就可获得。欲获得天,然活性态的目标产物必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应,有的天然活性。,变性蛋白的复性包含体是无定形的蛋白质的聚集不被,任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗,粒状致密低速离心就可获得。欲获得天,然活性态的目标产物必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应,有的天然活性。,包含体的优势,1、富集目标蛋白:包含体具有高密度,易于分离纯化的优势,2、抗蛋白酶:重组蛋白以包含体的形,式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋,白酶对目的蛋白的降解;,3、对宿主毒性小:生产那些处于天然,构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。,包含体形成的原因,主要是高水平表达的结果。,在高水平表达时,新生肽链的聚集速率超过,蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形,成,重组蛋白在大肠杆菌中表达时,缺乏一些蛋,白折叠过程中需要的酶和辅助因子,如折叠,酶和分子伴侣等,包含体的优势,1、富集目标蛋白:包含体具有高密度,易于分离纯化的优势,2、抗蛋白酶:重组蛋白以包含体的形,式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋,白酶对目的蛋白的降解;,3、对宿主毒性小:生产那些处于天然,构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。,包含体形成的原因,主要是高水平表达的结果。,在高水平表达时,新生肽链的聚集速率超过,蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形,成,重组蛋白在大肠杆菌中表达时,缺乏一些蛋,白折叠过程中需要的酶和辅助因子,如折叠,酶和分子伴侣等,包含体的组成与特性,般含有50%以上的重组蛋白,其余为,核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白,ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的,质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为,0.5-1um,无定形,难溶与水,只溶于变,性剂如尿素、盐酸胍等,二、包含体的分离和溶解,1、包含体的分离,收集重组菌,破碎细胞;离心除上清;使,用变性剂洗涤沉淀。,2、包含体的溶解,打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化,学键,使多肽链伸展。,溶解采用强的变性剂,如脲、盐酸胍,或硫氰酸盐,SDS,各种溶解方法都眢,有利弊。,含有半胱氨酸的蛋白质,需要加入还,原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。,加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。,三、包含体蛋白复性方法,几个要求,活性蛋白的回收率高,正确的复性的产物易于与错误的折叠,蛋白质分离。,折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质,产品,复性过程耗时少,1、稀释、透析复性法,蛋白质复性的最大问题,是在复性,过程中形成中间体和多聚体,中间体阻,碍作用大的使蛋白质正确折叠困难,复,性就困难;阻碍小或无阻碍的容易复性。,降低蛋白浓度可以减少中间体形成提高,复性率。,方法:在复性前用使用稀释、透析、过,滤及凝胶过滤除去变性剂、还原剂。将,变性蛋白连续缓慢的加入到复性缓冲液,中。复性中通过透析逐渐减少透析缓冲,液中的变性剂浓度。,复性缓冲液的pH要远离等电点,离子强度不易过高,10-50mmo/L,离子强度太高蛋白质易发生沉淀,也不,利于离子交换层析的分离;复性液温度,不易过高在4C-10C较合适,对于耐热,蛋白也可以室温复性;复性时向,以天,然表达的重组蛋白复性应在6hr以上,