第11章DNA文库的构建和目标基因的筛选

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十一章,DNA,文库的构建和目标基因的筛选,第一节 基因组,DNA,文库的构建,第二节,cDNA,基因文库的构建,第三节 基因克隆的筛选策略,第四节,DNA,文库的保存,基因库,(gene pool),：,特定生物体全基因组的集合,(,天然存在,),基因文库,(gene library),：,从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在,(,人工构建,),。根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因组文库：材料来自染色体,DNA,，含有全部基因组序列。,任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组,DNA,是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组,DNA,文库且具有一致性。,cDNA,文库：材料来自,mRNA,，含有全部蛋白编码基因的,cDNA,，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。,在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，,mRNA,种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的,cDNA,文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的,cDNA,文库依研究目标而定。,3,第一节 基因组,DNA,文库的构建,一、基因组,DNA,文库的类型和发展,1,、质粒文库：,容纳片段小于,15kb,，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。,2,、噬菌体文库：,一般用,载体，,插入型容纳片段小于,7kb,，适合于构建,cDNA,文库，置换型容纳,9-25kb,，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。,3,、粘粒文库：,一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比,文库略长，达,45kb,左右。,4,、人工染色体文库：,有,细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),、酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),、,P1,人工染色体,(P1 artificial chromosome,PAC),等文库，最大插入片段分别为,300kb,、,1000kb,和,300kb,，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。,4,5,、亚基因组文库：,文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、,PFGC,特定片段回收、特定,YAC,富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。,6,、基因组文库的发展：略,二、文库的代表性和随机性,代表性,意味着文库要有,完备性，,是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数,N,之间的关系可用下式表示：,N=ln(1 P)/ln(1 f),。,其中：,P,=,任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，,f,=,克隆片段的平均大小,/,生物基因组的大小,。,例：人的单倍体,DNA,总长为,3.2 x 10,9,bp,，假如文库中克隆片段的平均大小为,15 kb,，则构建一个完备性为,0.9,的,基因文库至少需要,45,万个克隆；而当完备性提高到,0.9999,时，基因文库至少需要,180,万个克隆,。,随机性,既表示构建文库时要从基因组,DNA,获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。,基因文库的质量标准,除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备,下列条件,：,1,、,重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；,2,、,载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆,3,、,克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；,4,、,克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；,5,、,重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。,1,、基因组,DNA,的制备,为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，,用于基因组,文库构建的,DNA,在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。,制备的,DNA,分子量越大,，经切割处理后样品中含有不规则末端的,DNA,片段的比率就越低，重组率和,完备性也就越高,。用,常规方法,制备的染色体,DNA,的长度一般在,100 kb,左右,。,A,A,A,A,如果先将细胞固定在,低融点凝胶,中，然后置入含有,SDS,、蛋白酶,K,、,RNase,的缓冲液中浸泡，可获得,1000 kb,大小的,DNA,片段,三、基因组,DNA,文库的构建流程,超声波处理,后的,DNA,片段呈,平头末端,，需加装人工接头,部分酶切法,一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶,，如：,Sau,3AI,或,Mbo,I,等，这样,DNA,酶解片段的大小可控。,2,、基因组,DNA,的切割,用于基因组,文库构建的,DNA,片段的切割一般采用,超声波处理,和,限制性内切酶,部分酶切,两种方法，其目的是：,第一，保证,DNA,片段之间存在部分重叠区；,第二，保证,DNA,片段大小均一。,连接前，上述处理的,DNA,片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以提高文库质量。,3,、载体和受体的选择与制备,出于压缩重组克隆的数量，用于,基因组,文库,构建的,载体通常选,装载量较大的,l,-DNA,或柯斯质粒；对于大型基因组,(,如动植物和,人类,),需使用,YAC,或,BAC,载体。,由于绝大多数真核生物的,mRNA,小于,10 kb,，因此用于,cDNA,文库,构,建的载体通常选质粒或插入型,l,载体,。,几种载体的最大装载量：,质粒,15 kb,，,-DNA 25 kb,，考斯质粒,45 kb,，,BAC 300 kb,，,YAC 1000 kb,。,用于基因,文库构,建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌，根据载体不同，需要对受体制备感受态或进行合适的培养。,载体制备中的注意事项：,1,）载体本身要完整,2,）载体去磷酸化要彻底,3,）载体纯度要高,9,4,、连接重组、包装、转化,/,染,连接,：将制备好的基因组,DNA,片段与载体,DNA,混合，在,T,4,DNA,连接酶酶的作用下进行连接，形成重组载体。,基因,DNA,和载体,DNA,片段要足够纯，杂质少；,连接时基因,DNA,片段与载体片段的摩尔比很重要，根据情况采用载体驱动或基因驱动策略；,连接酶容易失活，操作条件很重要，,16,连接一至数小时。,质粒载体等的连接产物可以直接转化宿主。,包装：,基因片段如果与,载体重组，则重组,需要包装进入特别制作的外壳蛋白中,(,包装蛋白要妥善保存,),，然后用于感染大肠杆菌，产生噬菌斑。,10,5,、文库的质量检测,克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高,(4-6,倍或更高,),；,文库的,滴度检测,：,1,微克包装,感染大肠杆菌后产生的噬菌斑的数量,(,pfu/,g,),，,100,万以上,才合格。,平均插入片段长度,：小片段文库采用酶切法或,PCR,法结合电泳进行检测，大片段文库采用,PFGE,电泳进行检测。,重组率,：有目标片段插入的克隆子数占总克隆子数的百分比，许多文库的载体系统可以采用蓝白斑鉴定重组率。,覆盖度,：覆盖倍数,=,平均插入片段长度,克隆数,/,基因组,DNA,的长度。,或：覆盖倍数,=,所有探针筛选到的阳性克隆子数,/,总探针数。,叶绿体,DNA,的比例：小于,5%,。,第二节,cDNA,基因文库的构建,一、,cDNA,文库的特征和发展,：,cDNA(complementary DNA):,以,mRNA,为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的,DNA,链,(,单链,cDNA,，反义链,),，以单链,cDNA,为模板还可以合成其反向互补链,(,取代,mRNA,的,DNA,链，正义链,),，得到双链,cDNA,。,将生物某一组织细胞中的总的,mRNA,分离出来作为模板，在,体外,用反转录酶合成,互补,的双链,cDNA,，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。这种方法所形成的所有克隆的集合体叫,cDNA,文库,。,1,）,cDNA,只含有对应于成熟,mRNA,的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。,2,）,cDNA,一般较短，平均长度,1.5kb,左右，多数为,100bp,至,10kb,。,3,）表达谱的时空动态性决定了,cDNA,文库的多样性。,4,）不同基因的,cDNA,间存在丰度上的差异。,二、,cDNA,文库的构建,：,1,、,RNA,的分离,mRNA,是构建,cDNA,文库的起始材料。总,RNA,中绝大多数是,tRNA,和,rRNA,，而,mRNA,只占总,RNA,的,1-5,，,平均为,2%,，,mRNA,的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于,mRNA,在总,RNA,中所占比例很小，因此从总,RNA,中,富集,mRNA,是构建,cDNA,文库的一个重要步骤。通过降低,rRNA,和,tRNA,含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。,利用,Poly(A),尾巴纯化或直接提取,mRNA,。,1,）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取,RNA,。,2,）保持,mRNA,的完整性，是构建全长,cDNA,文库的核心。,3,）选取合适的提取方法，除完整性外，,mRNA,还要求纯度高、,DNA,污染少，最好是采用无,RNase,的,DNase,去除杂质,DNA,。,4,）,RNA,定量准确，保存合理。,5,）根据目标和条件决定是否需要纯化,mRNA,或直接使用总,RNA,。,2,、第一链,cDNA,的合成,由,mRNA,到,cDNA,的过程称为,反转录,(reverse transcription,RT),，由,反转录酶,(reverse transcriptase,RTase),催化。反转录酶是依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，合成,DNA,是需要引物引导。常用的引物有：,oligo(dT),引物：在反应体系中加入高浓度的,oligo(dT),引物，,oligo(dT),引物与,mRNA 3,末端的,poly(A),配对，引导反转录酶以,mRNA,为模板合成第一链,cDNA,，反转录的是整个表达谱，可以产生全长,cDNA,，应用最广。,随机引物：与,mRNA,分子内的多处配对，从多个位置合成,cDNA,第一链，反转录的几乎是整个表达谱，最多只能产生近全长,cDNA,，适合于得到总,cDNA,的,5,末端。,基因特异引物,(gene-specific primer,GSP),：仅反转录特定目标基因,cDNA,的,5,末端。,有,AMV,和,MMLV,两种,RTase,，最适温度分别为,42,和,37,，需要敲除其,RNase H,活性，较高温度反转录有利于打开,mRNA,的二级结构，得到全长,cDNA,。,反转录过程中要防止,mRNA,降解，可以添加,RNase,抑制剂。,3,、第二链,cDNA,的合成,cDNA,第二链的合成就是将上一步形成的,mRNA-cDNA,杂交双链变成互补双链,cDNA,的过程。,4,种,cDNA,第二链合成的方法：,自身引导合成法,：解离的,cDNA,第一链的,3,末端会产生一个发夹状结构，可以引导第二链的合成，然后用,S1,核酸酶处理去除发夹结构。得到的,5,不完整，且,S1,核酸酶处理不好控制，易导致,cDNA,的丢失，所以该法现已少用。,置换合成法,：,RNase H,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,、,DNA,连接酶联合处理，得到近全长,cDNA,，,5,缺失短序列。,引导合成法,：利用末端转移酶在,cDNA,第一链的,3,末端加上,poly(dC),尾巴，利用,poly(dG),为引物引导第二链合成，利用同源多聚尾与载体进行重组。,引物,-,衔接头合成法：引导合成法的改进型，在反转录引物和,poly(dG),引物的,5,引入优化设计的人工接头，可用,PCR,扩增广大总,cDNA,，也为总,cDNA,与载体的连接提供了酶切位点。,15,4,、双链,cDNA,克隆进质粒或噬菌体载体并导入