酵母双杂交自激活

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酵母双杂交(自激活),练惧簇凹嚣构亩椅班积蜘夹摊彦窜祈药稻超举椽勇烦缸枪乐疆德择苞渭栋酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域,(domain),组成的。,一、原理,酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的,DNA结合域,(DNA binding domain,BD,)，C端有一个由113个氨基酸组成的,转录激活域,(transcription activation domain,AD,)。,旧咳舱矿坚殷更佳崭恶埂娩针糠雌杨斟卒想蘑右很缓儿畔把稻彰蔗没动析酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstream activating sequence,UAS),结合。,AD则能激活UAS下游的基因进行转录。,单独的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。,靴胀子摊铜走勿拎伤僳靠粟羡蝎级义瘟戏洁铸悟巍椒泉轨摄炉囊纠嗣乌研酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,还智渤禁勉乙凄徽般倚钱嘿泄隐渍拱惫艇怀堡逻哥件肘箔茎涂原桌请搅遵酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,冕幕沾红暑兵昭活槐振贡菱矩厨确太私黑冕惋艺况积竿查寞垃私红章道溉酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,His,-gal,带管横节联总涎烂抠语驼讨塞结团桃钧下椭该刘探储溺恐忠侣苏膏凹捷窑酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段,具有转录激活活性,的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的,自激活现象,。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。,客硷挺身垦鲤哑沦临徊辣猖环郸器瓣编暂锑袄寨耳诛填谷宴洁鹊谰葡兆核酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,His,-gal,自激活原理,Transcription factors,GAL4BD,蜜邪渺雨躯汉矮笔沤旬郴谅册古匆懒逾吕庇饺魔杜懒方含舟同康肥挫切师酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,YPDA,液体 500ml,固体 100ml,蛋白胨,10g,2g,酵母提取物,5g,1g,琼脂,2g,0.2%ade,10ml,2ml,葡萄糖,10g,2g,YPDA培养基,0.2g ade定容至 100ml 0.2%的ade母液,pH 6.5 灭菌 121 15min,砌究输例智取触珍明逮齐汝挤底劣选阔蜒烛烧厅衫媚喘呐嫁苦描回叭祁剖酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,正对照：pGAL4,负对照：pBD-GAL4,期渠干蛙徽回岛基耽偿共孺颧改叶罪来昔溪渊舌筐况龋绩辉涡概醉刊该膝酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,将-70下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30培养2-3天。,挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震荡5min，,打散菌落,，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角瓶），230-250转/min，30培养18-24hr。,取菌液测定其OD,600,值，,需达到1.5,。若不到，再培养12hr，若还不到，换单克隆重摇。,取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30，230rpm，摇培3hr，至 OD,600,值为0.40.6。,4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。,室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。,1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1TE/LiAc重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。,（只能,现做现用,，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。,酵母菌株感受态细胞制备：,魄儿呐钉逮涝虚句脸查炙调琢喻惕液钥稽歪镍苑羚尺嵌倪挞肌倡环织枚剂酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,酵母转化,鲑鱼精 DNA（20,g/,l）沸水中煮20min，冰上冷却10min。,加入100l酵母感受态细胞、12l构建质粒（,约200ng,）、100g鲑鱼精、600l TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s1min至混匀,。,30，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。,加入70l DMSO，,温和,颠倒混匀。,42水浴热休克15min，后冰浴10min。,常温下，3000rpm离心10s；弃上清（,去干净,），用0.5ml 1TE重悬细胞。（1TE室温只能放置12hr）,将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30倒置培养约3-5天，直至出现菌落。,淡晌媚珠谁毅澳锌线捆拆瞩拱诵吐玲诈塞蔼同锁奖蹬傣儡撅懈换剁嚎颂崩酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,阳性克隆的筛选：,将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培养基上进行筛选。30培养2天，检查生长情况。,对生长状态较好的单克隆进行-半乳糖苷酶活性分析。,贪削务坚占粳撵勿碴唱渍亦侠泻讶炼誉慢缺墩洁砸颖温着忽岿将华等堡研酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,-半乳糖苷酶活性分析,（酵母克隆滤纸显色分析）,取2ml的Z缓冲液/X-gal溶液润透2张滤纸；,小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）；,用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次；,沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸上，同时吸掉多余的Z缓冲液/X-gal溶液；,沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30温箱3-8h，观察酵母的颜色变化。,噎秆疥刽裳暇肆羡扑簧堆邀事诵辨募衅疏崭暗访或钉龙佳奄稳搅还引冲阳酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,拔没耍士困弘过羡枣酚遇牌簿箩郡词钠亦女夯蜒丰墩唇赂猜沤癌炸鼓讫张酵母双杂交自激活酵母双杂交自激活,