第三章 发酵液预处理 第四章微生物细胞破碎

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物工业下游技术,第三章 发酵液预处理,发酵液成分:微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。,目的:别离菌体和其他悬浮颗粒，除去局部可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。,方法选择:对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到掖相，然后经固液别离除去固相；对于胞内产物，那么应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后,目的产物进入液相，随后再将细胞碎片别离。,第一节 发酵液过滤特性的改变,微生物发酵液的特性可归纳为：,发酵产物浓度较低，大多为1一10，悬浮掖中大局部是水；,悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；,固体粒子可压缩性大；,液相粘度大，大多为非牛顿型流体；,性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。,这些特性使得发酵液的过滤与别离相当困难。,改善发酵液过滤特性的物理化学方法,通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流,体性能，降低滤饼比阻，提高过滤与别离的速率。,一、降低液体粘度：加水稀释法和加热法,二、调整pH：等电点沉淀法,三、凝聚与絮凝,四、参加助滤剂：助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。如：硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等。,五、参加反响剂：不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过滤速率。,凝聚与絮凝,凝聚,：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降,低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。,凝聚值,：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。反离子的,价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。,絮凝：,指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒,形成较大絮凝团的过程。,絮凝剂：,是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量,可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链,节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子或阳离,子基团以及不带电荷的非离子型基团。,目前，最常用的絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺。,第二节 发酵液的相对纯化,发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产品质,量利收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。,一、高价无机离子的除去,发酵液中主要的无机离子有：Ca2+；Mg2+；Fe2+等。,二、杂蛋白质的除去,(1)沉淀法：蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子三氯乙酸盐、水扬酸盐形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等形成沉淀。,(2)变性法：使蛋白质变性的方法很多，如：加热，调节PH，有机溶剂，外表活性剂等。其中最常用的是加热法。,(3)吸附法：参加某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。,第三节 固液别离工程及设备,范围：培养基、发酵液、某些中间产品和半成品。其,中发酵液由于种类多、粘度大和成分复杂，别离,最为困难。,方法：别离筛、重力沉降、浮选别离、离心别离和过,滤等，其中用于发酵液固液别离的主要是离心分,离和过滤别离。,一、离心别离,二、过滤别离,一、离心别离,原理：利用转鼓高速转动所产生的离心力来,实现悬浮液、乳浊液的别离或浓缩。,优点：别离速率快、别离效率高、液相澄清度,好等。,缺点：设备投资高、能耗大。此外，连续排料,时，固相干度不如过滤设备。,种类：多，按其作用原理不同，可分为过滤式,离心机和沉降式离心机两大类。,1碟片式离心机,2管式离心机,3倾析式离心机,二、过滤,原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液别离。,过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤两种。,澄清过滤：所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，填充于过滤器内即构成过滤层；也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管于等组成的成型颗粒滤层。,滤饼过滤：过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布，及毡、石棉扳、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。,滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。,1板框过滤机,2真空转鼓过滤机,3硅藻土过滤机,硅藻土：较纯二氧化硅矿石。化学性能稳定，具有极大的吸附和渗透能力，是良好的介质和助滤剂。,使用方法：,(1)作为深层过滤介质，以过滤含少量(01)悬浮固形物的液体。硅藻土不规那么粒子间形成许多曲折的毛细孔道，藉筛分和吸附作用除去悬浮液中的固体粒子。,(2)在支持介质(滤布)的外表上预涂硅藻土薄层(预涂层)，以保护支持介质的毛细孔道在较长时间内不被悬浮液中的固体粒子所堵塞，从而提高和稳定过滤速率。,(3)将适当的硅藻土分散在待过滤的悬浮液中，使形成的滤饼具有多孔隙性，降低滤饼的可压缩性，以提高过滤速率和延长过滤操作的周期。,用量：预涂，500g/m2左右，2-4mm厚；参加，01左右。,三、其他固液别离方法,1切向流过滤：又称错流过滤、交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质外表作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质外表的固体(滤饼)移走，过滤速率就近似恒定。,(1)用泵循环使悬浮液流经过滤介质。,(2)在过滤介质外表加以搅拌造成流动，产生切向流。,2双水相萃取,3吸附法：优点在于设备简单、能耗低，主要的问题是很难选择适宜的吸附剂，以保证目的产物不致于被吸附而损失。,第四章 微生物细胞破碎,微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分,子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化,酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内,部、如大多数酶蛋白、类脂和局部抗生素等，称为胞,内产物。,许多基因工程产品都是胞内产物。别离提取胞内,产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才,能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键,步骤。,第一节 细胞壁的组成与结构,细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物,其细胞壁的结构特性是不同的。,一、细菌细胞壁主要化学成分,：肽聚糖；,主要阻力脓聚糖的网状结构。,二、酵母茵细胞壁主要化学成分,：葡聚糖(30一34)、甘,露聚糖(30)、蛋白质(6一8)和脂类；,主要阻力壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,三、霉茵细胞壁主要化学成分,：几丁质和葡聚糖；,主要阻力几丁质或纤维素的纤维状结构。,细胞壁结构与细胞破碎：,细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破,碎的。,第二节 常用破碎方法,方法很多，按其是否使用外加作用力可分为机械,法和非机械法两大类。,机械法:有珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法等。在机械破碎法中，由于稍耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用冷却措施，以防止生物产品受热破坏。,非机械法:有酶溶法、化学法、物理法和枯燥法等，其中某些方法的应用受到限制。,目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法。,一、珠磨法,二、高压匀浆法,三、超声破碎法,超声破碎通常采用的超声破碎机在1525kHz的频率下操,作。其破碎机理尚未完全清楚，可能与空化现象引起的冲击波,和剪切作用有关。,超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌,种类型等因素有关。对不同菌种的发酵液超声破碎的效果差,别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞,比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。,优点,：操作简便，液量损失少，适合实验室规模。,缺点,：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递和,散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物,质失活。,四、酶溶法,利用酶反响,分解破坏细胞壁上的特殊键，从而,到达破壁的目的。,1 外加酶法:常用的溶酶有溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。,2自溶法:影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或枯燥法。,五、化学渗透法,(1)外表活性物质:可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,(2)EDTA螯合剂:革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,(3)有机溶剂:能分解细胞壁中的类脂。,(4)变性剂:变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,化学渗透法有如下优缺点：,优点：,(1)对产物释放具有一定选择性。,(2)细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于,固液别离和进一步提取。,缺点：,(1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的,细胞。,(2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过,50。,(3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过,程中需设法别离除去。,第三节 破碎率的测定与破碎 技术的研究方向,一、破碎率的测定,1直接测定法,2目的产物调定法,3导电串测定法,二、破碎技术的研究方向,1多种破碎方法相结合,2与上游过程相结合,3与下游过程相结合,