下一代测序技术在临床实验诊断中的应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,下一代测序技术在临床实验诊断中的应用,下一代测序技术在临床实验诊断中的应用,测序技术的发展,1954,年，,Whitfeld,等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列,1977,年,Sanger,等,发明的双脱氧核苷酸末端终止法，,Gilbert,等发明的化学降解法进行,DNA,测序,80,年代中期出现了以,荧光标记,代替放射性同位素标记、以,荧光信号接收器,和,计算机信号分析系统,代替放射性自显影的,自动测序仪,90,年代中期出现,毛细管电泳技术,测序技术的发展1954年，Whitfeld等用化学降解的方法,Sanger,测序技术指标,读长可达,1000bp,准确率,99.999%,每千碱基对测序成本仅,$0.5,每天的数据通量可以达到,600000bp,对于一代测序而言，其速度和成本已达到极限,。,Sanger测序技术指标读长可达1000bp对于一代测序而言,测序技术的发展,进入,21,世纪后，以,Roche,公司的,454,技术、,Illumina,公司的,Solexa,技术和,ABI,公司的,SOLiD,技术为标志的下一代测序技术诞生了。,2005,年底，,454,公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统,Genome Sequencer 20 System,，开创了边合成边测序（,sequencing-by-synthesis,）的先河,。,测序技术的发展进入21世纪后，以Roche公司的454技术、,“Next generation sequencing” Pubmed searching Jun 10,2015,“Next generation sequencing” P,For the First time: Whole-Genome Sequencing Delivers New Treatment Options for Twins with Rare Genetic Movement Disorder,For the First time: Whole-Geno,50-Hour Whole Genome Sequencing Provides Rapid Diagnosis for Children With Genetic Disorders,Sauders et al., Sci Transl Med 3 October 2012 4:154ra135. DOI:10.1126/scitranslmed.3004041,50-Hour Whole Genome Sequencin,下一代测序（,NGS,）已逐渐应用于临床分子诊断,下一代测序（NGS）已逐渐应用于临床分子诊断,不同规模的,NGS,实验在临床分子诊断中的应用,全基因组测序（,Genome,）： 产前诊断,全外显子组测序（,Exome,）： 发现、鉴定致病基因,靶向目标基因测序（,Panel,）：临床分子诊断,不同规模的NGS实验在临床分子诊断中的应用全基因组测序（Ge,临床分子诊断中各种测序方法的优劣比较,临床分子诊断中各种测序方法的优劣比较,Contribution of different factors to the overall cost of a sequencing project across time,Contribution of different fact,在临床诊断领域首次利用,WES,，对一例原先怀疑为,Batter,综合征的患儿作出了先天性氯化物丢失性腹泻的正确诊断，该患儿发生了,SLC26A3,基因的,D652N,的新生纯合突变,NGS,在临床分子诊断中的应用,在临床诊断领域首次利用WES，对一例原先怀疑为Batter综,NGS,在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用,(1),将,NGS,技术作为常规诊断试验进行候选基因突变筛查对于神经肌肉系统疾病患者的临床诊疗和遗传咨询具有重要价值,NGS在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用(1)将NGS技术作,NGS,在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用,(2),DMD,和,BMD,是最常见的,NMD,DMD,基因巨大，常规方法难度大,89,例,DMD,和,BMD,患者，,18,例女性携带者和,245,例非,DMD,患者,CNV,：,99.99%,精确性,和,98.96%,敏感性,SNV,：,100%,准确率,9,例患者发生部分外显子缺失，可知精确断裂位置信息,NGS在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用(2)DMD和BMD,NGS,在视网膜疾病分子诊断中的应用（,1,）,较之传统的分子诊断方法（如采用,Sanger,测序技术逐个基因进行分析），,NGS,能够有效提高各种类型视网膜疾病分子诊断的能力和效率；同时能有效降低分子诊断的费用,NGS在视网膜疾病分子诊断中的应用（1）较之传统的分子诊断方,NGS,在视网膜疾病分子诊断中的应用（,2,）,Glockle, et al. Eur J Hum Genet (2014) 22, 99104,105,个已知视网膜疾病致病基因组成的,NGS,诊断,panel,107,例临床未经筛选的视网膜疾病患者,视网膜变性患者的分子诊断率：,55%,BardetBiedl,综合征或,Usher,综合征患者：,80%,均发现致病或候选致病变异,NGS在视网膜疾病分子诊断中的应用（2）Glockle, e,NGS,在遗传病携带者检测中的应用,利用,NGS,技术，能对严重影响儿童健康的遗传病进行全面、系统筛查,NGS在遗传病携带者检测中的应用利用NGS技术，能对严重影响,NGS,在线粒体疾病分子诊断中的应用,42,例经常规基因检测未能诊断的婴儿型线粒体病,此,panel,包含线粒体基因组、,100,个已知线粒体病致病基因及,1000,个与线粒体功能相关基因,与正常人相比，患者群体中具有功能影响的变异（罕见变异、影响蛋白功能的变异及隐性遗传的变异）负荷增加了,5,倍,55%,存在隐性基因突变或致病性线粒体基因突变：,10,例（,24%,）,患者进行明确的分子诊断；,13,例（,31%,）,患者出现核基因突变，其中,2,例,患者的突变经功能研究发现可疑引起线粒体病,NGS在线粒体疾病分子诊断中的应用42例经常规基因检测未能诊,NGS,在产前诊断中的应用,利用,NGS,技术对孕妇外周血中的,cfDNA,进行无创产前诊断（,noninvasive prenatal testing , NIPT,）已成为该领域的发展趋势,基于孕妇外周血无细胞血浆胎儿,DNA,的无创产前诊断的,21,三体（,0.3% vs. 3.6%, PT, p.D1604Y,WES用于家族性马蹄内翻足的临床分子诊断 FLN,WES,用于,先天性关节挛缩畸形,的临床分子诊断,WES用于先天性关节挛缩畸形的临床分子诊断,WES,用于出血病患者的分子诊断,WES用于出血病患者的分子诊断,病人资料,患者，女性，临床类似血友病出血表现,用凝血酶原复合物治疗有效,DIC,、凝血因子活性检测均正常,VWD,排除,血小板功能正常,其弟与其有相似的临床出血表现，父母为近亲婚配,遗传性出血性疾病（凝血因子功能缺陷？）,病人资料患者，女性，临床类似血友病出血表现,NGS,结果,631AC, 211TP,F10,基因,NGS结果631AC, 211TP F10基因,表型诊断,APTT:,50.2s,F: 124.9%,PT:,11.3s F: 76.7%,INR:,0.98 F: 118.7%,FIB:,3.71g/L F: 80.7%,F:,109.8%,F:,100.4%,F: 72.0%,F,(PT,法,):,108.3%,表型诊断APTT: 50.2s,FX:C,（,APTT,法）,=4.36%,病人凝固时间,=76.7s,FX:C（APTT法）=4.36%病人凝固时间=76.7s,发色底物法：,FX:C=109.4%,Thromb Haemost.,2013 Jul;110(1):53-61.,发色底物法：FX:C=109.4%Thromb Haemos,NGS,应用于疾病基因诊断存在的问题,基因变异致病性的确定（,缺乏统一、精确注释、经审核的基因型,-,表型数据库,;,文献报道中有,27%,的致病变异实为多态性或注释错误,Sci. Transl. Med.,2011,3, 65ra4,）,偶然发现结果的报告（,ACMG,指南及引发的争议）,NGS,实验中目的片段测序的不完整性（可能丢失致病性变异）,缺少非编码区域致病性变异的发现工具和知识,NGS应用于疾病基因诊断存在的问题基因变异致病性的确定（缺乏,利用,NGS,进行遗传病分子诊断的质量控制,在应用,NGS,进行遗传病的分子诊断过程中，必须对,NGS,实验和数据分析的各个方面进行严格的质量控制以保证结果的真实、可靠,Arch Pathol Lab Med. doi: 10.5858/arpa.2014-0250-CP,Nat Biotechnol.,2012 Nov;30(11):1033-6,利用NGS进行遗传病分子诊断的质量控制在应用NGS进行遗传病,NGS,应用于遗传病分子诊断的未来,Lu, et al. N Engl J Med,.,2014 Aug 14;371(7),在许多遗传性疾病中，普遍存在等位基因异质性（同个基因不同的变异）和基因座位异质性（同一种疾病具有不同基因的变异），需要积累更多的表型,-,基因型信息,需要更精细和更标准化的表型信息,Hum Mutat 33:884886, 2012,测序费用下降、基因型驱动的分子诊断？,NGS,需要下一代表型,NGS应用于遗传病分子诊断的未来Lu, et al. N E,下一代测序技术在临床实验诊断中的应用课件,