内毒素、13-β-葡聚糖和降钙素检测的临床应用

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,内毒素、,1,，,3-,葡聚糖和降钙素原检测的临床应用,安徽省立医院 检验科,戴媛媛,内毒素概述,内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖LPS，这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。,外层,菌体多糖（,O,抗原），与细菌侵袭力有关。,中层,同一种属之间是相同的。,内层,特殊的糖磷脂，起毒性作用，而无种属特异性。,特异性多糖,核心多糖,类脂,A,内毒素的结构,发热反应,1,激活血管活性物质的释放,2,激活凝血和纤溶系统,3,内毒素的生物学活性,直接或间接损害肝脏,5,激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统,6,内毒素的生物学活性,激活补体,4,内毒素的有益作用,增加机体非特异性免疫力,1,防御放射性损伤，促进粒细胞生成,2,增加网状内皮系统功能,3,抗肿瘤，免疫佐剂作用,4,内源性,内毒素血症,外源性,内毒素血症产生原因,肠道内毒素的吸收,1,败血症时血中细菌的释放,2,3,有效的抗菌治疗后，细菌崩解,输入了含有细菌的药物、血液或者体液等。,内毒素血症临床病症主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。病症和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统病症，以及休克、血压下降、组织灌流缺乏、缺氧及酸中毒等。,内毒素血症的临床病症,最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，,DIC,等。病死率极高。,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、爆发性肝炎58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。,各类疾病内毒素血症的发生率,内毒素检测的临床应用,在肝胆疾病中的应用,1,在呼吸系统感染中的应用,2,在胰腺疾病中的应用,3,在溃疡性结肠炎中的应用,4,在全身性细菌感染中的应用,5,在不明原因发热中的应用,6,内毒素检测在医院中的应用,在医院灭菌制剂检验中应用,1,对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测,2,在透析站和血站中的应用,3,在临床医学研究中的应用,4,鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反响的现象，作为判断试品中细菌内毒素含量的一种方法。,内毒素的检测方法,背面观,就像是古代武士的心甲,腹面观,腹部基本呈六角形，,还可以看到它发达的附肢,内毒素的检测原理,G,G,内毒素的检测方法,鲎试剂Limulus amebocyte lysate LAL),凝胶法,0.03EU/ml,范围内半定量,1,浊度法,0.006-300EU/ml,检测范围大,2,比色法,0.006-15EU/ml,范围内定量,3,ELISA0.1pg/ml,4,流式细胞术,测内毒素的量而不是活性,5,化学发光测定法,6,内毒素检测的参考值,10pg/ml,以下 ： 健康人值,10-20pg/ml,： 病变观察期,大于,20pg/ml,： 内毒素血症,肝炎 败血症 肿瘤,内毒素浓度,50-320 20-1000 20-700,(1-3)-,-D-,葡聚糖,侵袭性真菌感染的定义,定义,:,指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。,条件致病性真菌,念珠菌属,曲霉属,其他,侵袭性真菌感染的特点,1.,不产生内毒,素和外毒素,致病机理不明,4. 早期病症无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高,2.,致病力一般,较弱，机体免,疫低下时发生,3.,感染菌种变化， 白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增长趋势上升明显,1.,内源性诱因,2.,外源性诱因,影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、,肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等,广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；,插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；,免疫缺陷综合症,侵袭性真菌感染的诱因,侵袭性真菌感染IFI现状,IFI,诊断困难及漏诊情况严重,IFI,发生率不断增加,IFI,感染病死率很高,1,2,3,国内侵袭性真菌感染不容无视,刘正印等，中华医学杂志,2003,83(5):399-402,感染人数,国内侵袭性真菌感染不容无视,临床药物治疗杂志,2007,年第,5,卷第,1,期,感染率,(%),中国感染与化疗杂志2021 年7 月20 日第 8 卷第4 期,尸检研究发现，,75%,的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊,诊断困难的主要原因：,- 临床表现不典型，易被根底疾病所掩盖,- 确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者,的病情所限难以实施,- 真菌检测工程开展相对缺乏或滞后,IFI,诊断困难及漏诊情况严重,主要可引发侵袭性真菌感染的疾病,肺炎,肺纤维症,脑出血,脑堵塞,硬膜下血瘤术后,胸部大动脉瘤术后,糖尿病,再生障碍性贫血,MODS,DIC,胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤,肺结核,腹腔内脓肿,AIDS,呼吸系统,疾病,感染症及,寄生虫病,循环系统,疾病,内分泌,疾病,血液及造血,器官疾病,肿瘤类,侵袭性真菌感染,( invasive fungal infection, IF I),的发病率,逐年上升,其中又以,侵袭性肺部真菌感染,( invasive pulmonary fungal infection, IPF I),最常见,大约占,50%,60%,。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的,病死率可高达,30%,80%,。,侵袭性肺部真菌感染,临床表现,：,缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。,现 状,：,两高两低一快,检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。,高院内感染率和病死率,低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快,侵袭性肺部真菌感染,死亡率,(%),诊断延迟,时间,(h),ICU,诊断延迟时间与死亡率的关系,11,33,30,35,10,15,20,25,30,35,12 h,12-24 h,24-48 h,48 h,Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:36403645.,美国四大医疗中心做的一项回忆性研究,死亡率,(%),诊断延迟时间,(d),Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:2531 .,b,1,6,葡聚糖,磷脂双分子层,几丁质,麦角固醇,b,1,3,葡聚糖,合成酶,mannoproteins,1,3,真菌细胞膜、壁结构,羊毛固醇C14去甲基化酶,14位复原和78位异构酶,角鲨烯环氧化酶,1-3-D-,葡聚糖本质及特点,真菌细胞壁成分，占,50%,以上,1,其他微生物、动物及人的细胞不含该成分,2,用于侵袭性真菌感染的早期诊断,3,(1-3)-D-,葡聚糖特性,1.,2.,3.,对热极为稳定，高压,121,并不能使其灭活。,在念珠菌和曲霉菌细胞,壁中含量较多，对,G,试验灵敏,。,当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其去除。,在浅部真菌感染中，,(1-3)-D-,葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。,“G试验缘何而来？,1-3-D,-,葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的,G,因子，引起裂解物凝固，故称,G,试验。,（,1-3,）,-D-Glucan,LAL-RM(,反应物,),G,因子,活化,G,因子,凝固酶原,凝固酶,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝胶）,试验反应机理图：,内毒素与-葡聚糖的检测比较,能与鲎试剂发生反响的物质有细菌内毒素和-葡聚糖，但它们的反响曲线不一样。内毒素反响曲线为S型特征曲线，而-葡聚糖反响曲线为经过0点的斜线。,内毒素和-葡聚糖与鲎试剂反响的特征曲线,观察期不确定，费时费力，特征性不明显并对医师的专业水平要求高,辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等,用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点,3.PCR,技术：,真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测,对儿童及接受造血干细胞移植患者、,ICU,患者不适用,2.GM,试验：,曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测。判断是否曲霉属真菌感染,耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度,1.G,试验：,通过检测,(1-3)-D-,葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染,非传统,检查,敏感性低，耗时长,培养阳性率低。培养结果是定性的，有些标本采集困难,直接培养真菌法,传 统,检 查,特 点,方 法,侵袭性真菌感染的临床检测方法比照,D,葡聚糖的评价,可检测多种致病真菌感染,念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，,毛孢子菌等,不能检测隐球菌、接合菌根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等,敏感性、特异性：90左右,对于念珠菌血症, G试验检测是首选检查,J. Clin. Microbiol. 2021.46:10091013.,BG值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值,Pazos等报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等病症和肺部HRCT检查发现以前 。,平均早于发热5 d,早于呼吸道病症平均10.7 d,J Clin Microbiol，2005，43(1)：299305,G,试验检测评价,Odabasi,等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为期,3,周每周,2,次采血检测及临床观察,发现：,BG,值开始高于,60 pg,ml,的时间比最后确诊为,IFI,或临床诊断,IFI,平均提前了,10 d,Clin Infect Dis,，,2004,，,39(2),：,199205,G,试验检测评价,D,葡聚糖参考值,健康人：,20,p,g/ml,关于,G,试验,建议,G试验临床应用,1明确诊断,抗真菌药物治疗前,2治疗效果监测,抗真菌药物治疗后,3连续2次采血进行G试验,临床细菌内毒素及(1-3)-D-Glucan检测的国内外开展,国外：血液包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等中内毒素以及(1-3)-D-Glucan微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)-D-Glucan检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测工程。,国内：MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的检测临床内毒素及(1-3)-D-Glucan的专用仪器，同时具有配套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set获得SDA批准文号,降钙素原,生化结构和生物合成,1,生物来源,2,降钙素原概述,116,个氨基酸组成，相对分子量为,13 KD,的糖蛋白。在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网合成。,人血清,PCT,含量极低，约,0,0025 g/L,。当发生严重细菌感染和败血症时，其浓度可增高,10000,倍。在甲状腺切除后严重感染患者血中,PCT,的浓度仍升高，推测各种器官中的巨噬细胞和单核细胞可能是败血症时,PCT,的来源。,PCT的半衰期大约为2024 h。PCT的去除途径尚不完全清楚。它很少经肾脏排出。因此血浆PCT检测也适用于肾衰或人工肾治疗的患者。,代谢,3,降钙素原概述,PCT,的临床应用特点,高敏感性和特异性,1,出现时间早,2,半衰期短,3,不受机体免疫状态的影响,4,PCT,的临床应用特点,可鉴别诊断全身与局部细菌性感染,5,可诊断良恶性肿瘤是否有继发感染,6,鉴别诊断新生儿败血症及败血症休克,7,可判断是呼吸道感染是否使用抗生素,8,PCT,的检测方法,凝胶层析法和高效液相色谱法,1,酶免法和放免法,2,金标法,3,免疫荧光法,4,总 结,PCT,是一项快捷、有效的常规实验指标，可帮助临床诊断、疗效观察与指导用药。,谢谢,