TALENs的靶向基因修饰技术易懂版

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,TALENs的靶向基因修饰技术TALENs-,transcription activator-like effectors,nucleases,简介,Cas9,锌指核酸酶技术,(ZFN),转基因技术,RNAi技术,生物应用模型构建,基因组靶向修饰,TALENs,一般的基,因敲除,什么是基因敲除？,是指对一个构造但功能未知的基因，从分子水平上设计试验，将该基因去除，或用其它挨次相近基因取代，然后从整体观看试验动物表型，推想相应基因的功能。,基因敲除是自80年月末以来进展起来的一种新型分子生物学技术。,基因敲除的技术根底,基因敲除,胚胎干细胞（,ES,）分离,体外培养技术,1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的进展和完善。,基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而到达基因敲除的目的。,交叉互换,基因敲除的技术根底,利用同源重组构建基因敲除动物模型的根本步骤,构建重组载体,表型研究,获得,ES,细胞,鉴定,筛选阳性细胞,同源重组,选择纯合子,TALEN基因敲除技术,TALEN Transcription Activator-Like Effector Nucleases ,转录激活子样效应因子核酸酶,科学家觉察自然的TALENs最初是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的，将它应用于基因修饰方面，使它成为了一种崭新的分子生物学方法.,TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。 2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。试验设计 简洁准确、试验周期短、本钱低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶状况少。 4. 抑制了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列常常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。,TALEN基因敲除技术,每周,人们可以对基因组的特定位点进行各种遗传操作, 包括基因打靶、基因定点插入、基因修复等, 从而能够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰。,TALENs,可识别并结合特定的,DNA,序列,并通过切割这一序列的特定位点造成,DNA,的双链断裂,(DSB),细胞利用天然的,DNA,修复过程非同源末端结合（,NHEJ,）导致,DNA,断裂处碱基的变异，造成翻译蛋白的移码突变，从而不能产生正确的蛋白质，,即最终实现基因敲除,。,技术原理,TALEN基因敲除技术,应用,TALENs,作用机制,结构及其构建,TALEN基因敲除技术,TALE,蛋白能识别并结合特异的,DNA,序列，,Fok I,则可通过二聚体化产生核酸内切酶活性,从而在特定的位点切断,DNA,序列，造成,DNA,的双链断裂,(Double-stand break, DSB),。,TALENs构造,TALE,蛋白的,DNA,结合结合域,Fok I 核酸酶的切割构造域,TALENs构造的构建,TALE模块识别DNA的机制在于不同的双连氨基酸残基VD能够特异地分别识别A、T、C、G 4 种碱基中的一种。,通过对自然TALE 的争论觉察，有20多种不同的VD可以特异性的识别碱基，其中 Asn /Ile( NI)识别碱基A; His /Asp( HD)识别碱基C; Asn/Gly(NG)识别碱基T; Asn /Asn( NN)识别碱基G/A。,VD 的第1 位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到稳定VD 的作用; 第2 位氨基酸则直接与DNA 的碱基特异识别,TALENs构造的构建,TALE,是由,12,和,13,以上特异性识别,DNA,的串联,“,蛋白模块,”,和两侧的,N-,末端及,C-,末端序列组成。每个,“,蛋白模块,”,包含,34,个氨基酸，第,12,和,13,位双连氨基酸残基,(RVDs),是靶向识别的关键位点，,TALEs,上的每个,RVDs,仅能识别一个碱基,这样就产生了一连串的识别序列。,TALENs构造的构建,TALENs构造的构建,将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需构造域并在C端融合有FokI序列。,目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻间隔17碱基的靶序列14 - 18个碱基分别进展TAL识别模块构建。,TALENs的作用机制,将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI接近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA， 形成DSBDouble-Strand Breaks，诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源末端结合NHEJ修复DNA， 在此修过程中或多或少地删除或插入了确定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。,TALENs基因靶向修饰技术的应用,建立生物模型。,在基因功能，代谢途径等争论中模型生物的建立特殊重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进展相关的争论。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠、线虫、酵母，斑马鱼等的基因敲除模型也常见于报道。,疾病的分子机理争论和疾病的基因治疗。,通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及争论它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是查找基因治疗的靶目标都有重大的意义。,谢谢！,