血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,血清白蛋白、-球蛋白的分离、纯化及鉴定,分离纯化的一般程序,选择材料,破碎细胞,提取,分离纯化,分析及鉴定,（粗分级，细分级）,（预处理）,实验目的,通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白和,-球蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能。,实验原理,1.,初分级,:,血清经,饱和硫酸铵,盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。,2.,脱盐,:,用,凝胶色谱,法除去分离样品中的盐类,。,3.,细分级,:,用,离子交换色谱,法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样品提取纯化的,-球蛋白。,4.,鉴定,:,用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。,1.盐 析,原理,:,当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。,不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中，血清,球蛋白,会沉淀，经离心后，可与,白蛋白,分离开。,影响因素：,PH,、,温度、蛋白质纯度等。,逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。,操 作,操 作,一、盐析,白蛋白、球蛋白的粗分离,取0.5ml血清,取0.5ml饱和(NH,),SO,溶液，,缓慢滴入，,边加边摇,。,混匀后于室温中放置10分钟。,8000r/min10min,小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。,沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化 球蛋白用。,2.,脱 盐,盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要,脱盐,。,凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。,凝胶过滤的原理,洗脱液中蛋白质及盐分的检查,取96孔板一块，上四排加20磺基水杨酸，下三排加BaCl,2,液。,从下端管口取1滴洗脱液，滴于20磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，,开始收集蛋白样品,。,从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl,2,中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，,不再收集,。,二、G-25凝胶层析脱盐,（一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备,（二）上样与洗脱：,1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。,2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。,3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量,pH6.5,的0.02mol/L,NH,4,Ac,缓冲液。,4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测，20磺基水杨酸检测到蛋白后收集,三管,，,10滴/管,。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。,5、BaCl,2,检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。,6、平衡再生：继续洗脱30ml。,7、白蛋白样品脱盐。15滴/管，收集,三管。,3.纯 化,离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术,。,原理：,离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子（反离子）结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。,阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离子。,阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离子。,+,+,+,+,+,+,AC,-,AC,-,AC,-,AC,-,AC,-,AC,-,0.02M,NH,4,AC,+,+,+,+,+,+,蛋白样品,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,AC,-,AC,-,AC,-,AC,-,AC,-,AC,-,NH,4,+,NH,4,+,0.06-0.3M,NH,4,AC,-,-,得到纯化的,-球蛋白,得到纯化的,白蛋白,-球蛋白带正电,白蛋白,、,球蛋白,带负电,阴离子交换剂,三、纯化（阴离子交换层析）,将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用0.02mol/L NH,4,Ac缓冲液洗脱，,分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴/管，编号。（,纯化的,-,球蛋白,）,继续洗脱30ml,将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH,4,Ac洗脱30ml。（,去掉,、-球蛋白,，午餐休息1小时）,改用0.3mol/L NH,4,Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（,纯化的白蛋白,）,再生：0.3mol/L NH,4,Ac 20ml，0.02mol/L NH,4,Ac40ml,四、醋酸纤维素薄膜电泳检查,（1）血清,（2）粗分的-球蛋白液,（3）粗分的白蛋白液,（4）纯化的-球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（2次），每次点样时待干后再点。,（5）纯化的白蛋白液,样品：,操作步骤：,准备与点样,2.,电泳（点样面朝下，,110V 1h,）,氨基黑,B,染色,2cm,粗糙面,