氨基酸的薄层层析-分离鉴定氨基酸混合液课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,*,*,1,如何分离鉴定氨基酸混合液？,生物化学与分子生物学实验教学中心,如何分离鉴定氨基酸混合液？生物化学与分子生物学实验教学中心,1,氨基酸的薄层层析,(Thin layer chromatography of amino acids),生物化学与分子生物学实验教学中心,氨基酸的薄层层析(Thin layer chromatog,2,实验目的,掌握薄层层析法的一般原理。,掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。,掌握如何根据移动速率（R,f,值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验目的掌握薄层层析法的一般原理。09年秋季学期生物化学与分,3,层析技术,概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。,特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析技术概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度,4,层析的基本过程,组分A,组分B,+,流动相,固定相,吸附,溶解,结合等,解除上,述作用,反复进行,组分A,组分B,移动速度不同,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析的基本过程 组分A+ 流动相固定相吸附解除上反复进行组分,5,层析法的分类,气相层析（以气体为流动相的层析法）,液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）,1.吸附层析：,薄层吸附层析、,吸附柱层析,2.分配层析：纸层析、柱层析、,薄层层析,3.离子交换层析,4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析,5.亲和层析,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析法的分类气相层析（以气体为流动相的层析法）09年秋季学期,6,实验原理,1.薄层层析法是色谱分析技术的一种,一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为,固定相,。当,液相,（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的,吸附力不一样,，不同氨基酸在展开溶剂中的,溶解度不一样,，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的,移动速率也不同,，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验原理 1.薄层层析法是色谱分析技术的一种09年秋季学期,7,2. 氨基酸与茚三酮的显色反应,茚三酮水化后生成,水化茚三酮,，它与氨基酸的羧基反应生成,还原茚三酮,、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成,蓝色化合物,而使氨基酸斑点显色。,实验原理,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水,8,茚三酮反应(ninhydrin reaction),09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,茚三酮反应(ninhydrin reaction)09年秋季,9,实验原理,3.,混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率R,f,值（rate of flow）来表示。,层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为R,f,值。,由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（R,f,值）也是恒定的，因此可以,根据R,f,值来鉴定被分离的物质。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验原理3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁,10,实验材料,吸附剂：,硅胶,粘合剂：,0.5%的羧甲基纤维素钠,氨基酸的异丙醇溶液,丙氨酸、精氨酸、甘氨酸,展开-显色剂,（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）,分析样品：,氨基酸混合液,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验材料吸附剂：硅胶09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教,11,器材,层析板、尺子、铅笔,烧杯、量筒,喷雾器、吹风机,毛细管、层析缸,药匙,烘烤箱,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,器材层析板、尺子、铅笔09年秋季学期生物化学与分子生物学实验,12,操作步骤,薄层板的制备,1、调浆,称取,硅胶3克,，加,0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升,，调成均匀的糊状。,2、涂布,取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。,3、干燥,将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。,4、活化,70烘干30分钟。,切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 薄层板的制备 1、调浆 称取硅胶3克，,13,操作步骤,点样,2cm,1cm,1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距1cm。,2、用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。,3、加样后原点扩散直径不超过2mm。,4、待点样点干后再重复点一次。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 点样2cm1cm1、位置：,14,操作步骤,展层、显色,将薄层板,点样端,浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应,低于,点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，,用铅笔描出溶剂前沿界线,，用热风吹干或在85下烘干，即可显出各层斑点。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色,15,注意事项,1.切勿用手直接接触薄层板面。,2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。,3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,注意事项1.切勿用手直接接触薄层板面。09年秋季学期生物化学,16,R,f,=,斑点至原点距离,溶剂前缘至原点距离,结果计算,小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的 ,值。,根据,值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,斑点至原点距离溶剂前缘至原点距离结果计算 小心量,17,复习思考题,氨基酸薄层层析的基本原理是什么？,按原理分类，层析分为哪些？主要原理各是什么？,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,复习思考题氨基酸薄层层析的基本原理是什么？09年秋季学期生物,18,生物化学与分子生物学实验教学中心,Thank You !,生物化学与分子生物学实验教学中心Thank You !,19,