内毒素检查专题知识专家讲座

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,目录,1,、试验原理,2,、试验试剂,3,、试验器具,4,、检验方法概述,5,、供试品溶液制备,6,、内毒素限值确实定,7,、最大有效稀释倍数（,MVD,）确实定,8,、鲎试剂灵敏度复核,9,、干扰试验,10,、供试品细菌内毒素检验,内毒素检查专题知识专家讲座,第1页,试验原理,利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应现象，以判断供试品中细菌内毒素限量是否符合要求一个方法。,阳性结果,细菌内毒素量用内毒素单位,(EU),表示。,内毒素检查专题知识专家讲座,第2页,试验试剂,鲎试剂,从海洋无脊椎动物“鲎”蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成生物制剂。,鲎试剂生物活性以其能检出细菌内毒素最低有效浓度表示，即鲎试剂灵敏度，单位为,EU/ml,。,当使用新批号鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。,内毒素检查专题知识专家讲座,第3页,试验试剂,细菌内毒素国家标准品,系自大肠埃希菌提取精制得到内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。,细菌内毒素工作标准品,系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。,细菌内毒素检验用水,指内毒素含量小于,0.015EU/ml,（用于凝胶法）或,0.005EU/ml,（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用灭菌注射用水。,内毒素检查专题知识专家讲座,第4页,试验器具,刻度吸管、凝集管（,1075mm,）、三角瓶、小试管（,16100mm,）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。,耐热器皿惯用干热灭菌法（,250,、,30,分钟以上）去除，塑料用具应选取标明无内毒素而且对试验无干扰器械（当前多为无热原一次性用具）,。,内毒素检查专题知识专家讲座,第5页,试验准备,1,、清洗洁净玻璃容器、注射器、镊子、剪刀等放入金属制容器内密闭加热去热原，到达时间后，关闭电源。待烤箱温度自然降低至室温，在不开启金属容器情况下，可一周内使用，不然必须再次加热除去可能存在外源性内毒素。,2,、塑料制品清洗洁净后在,30%,双氧水中浸泡,4H,，再用无热原水充分冲洗后在,60,烘箱中烘干备用，普通我们会把枪头装入盒中进行湿热灭菌。,3,、试验前应先把水浴锅或恒温器温度调到,37 1,。,内毒素检查专题知识专家讲座,第6页,检验方法概述,凝胶法,限量试验,半定量试验,光度测定法,浊度法（终点浊度法和动态浊度法）,显色基质法（终点显色法和动态显色法）,凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典“仲裁”方法,对干扰相对不敏感。,较光度测定法不灵敏,内毒素检查专题知识专家讲座,第7页,供试品溶液制备,一些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。,普通要求供试品溶液,pH,值在,6.0,8.0,范围内。,可使用酸、碱溶液或适宜缓冲液调整,pH,值。,内毒素检查专题知识专家讲座,第8页,内毒素限值确实定,普通按公式：,L=K/M,式中,L,为供试品细菌内毒素限值，以,EU/ml,、,EU/mg,或,EU/U,（活性单位）表示。,K,为人每千克体重每小时最大可接收内毒素剂量。注射剂,K=5EU/,（,kgh,），放射性药品注射剂,K=2.5EU/,（,kgh,），鞘内用注射剂,K=0.2EU/,（,kgh,）。,M,为人用每千克体重每小时最大供试品剂量，依据药品使用说明书，,临床用药须知,确定。,例：,某产品,M,为,14.3mg/kg,，,L=5/14.3=0.35EU/mg,假如此产品浓度为,100mg/ml,，那么，,L=0.35,100=35EU/ml,内毒素检查专题知识专家讲座,第9页,最大有效稀释倍数确实定,最大有效稀释倍数（,MVD,）,指在试验中供试品溶液被允许稀释最大倍数，在不超出此稀释倍数浓度下进行内毒素限值检测。,MVD=cL/,式中,L,为供试品细菌内毒素限值；,c,为供试品溶液浓度，当,L,以,EU/ml,表示时，则,c,等于,1.0ml/ml,，当,L,以,EU/mg,或,EU/U,表示时，,c,单位需为,mg/ml,或,U/ml,。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则,MVD,取,1,，可计算供试品最小有效稀释浓度,c=/L,；,为在凝胶法中鲎试剂标示灵敏度（,EU/ml,）。,内毒素检查专题知识专家讲座,第10页,鲎试剂灵敏度复核,目标,考查鲎试剂灵敏度是否准确、考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合要求。,当使用新批号鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。,细菌内毒素标准溶液准备,1,、,取细菌内毒素工作标准品（或国家标准品）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，,75%,酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应预防玻璃屑落入瓶内。,内毒素检查专题知识专家讲座,第11页,鲎试剂灵敏度复核,2,、,按照标准品说明书，加入要求量细菌内毒素检验用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合,15,分钟。然后进行稀释，制备成,4,个浓度细菌内毒素标准溶液，即,2,、,、,0.5,和,0.25,（,为所复核鲎试剂标示灵敏度）四个浓度内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀,30,秒钟,。,示例,某待复核鲎试剂灵敏度标示值为,0.25EU/ml,，细菌内毒素工作标准品规格为,150 EU/ml,，将细菌内毒素工作标准品用,1ml,细菌内毒素检验用水溶解，再稀释制备成浓度为,0.50 EU/ml,，,0.25EU/ml,，,0.125EU/ml,和,0.06EU/ml,细菌内毒素标准溶液。,内毒素检查专题知识专家讲座,第12页,鲎试剂灵敏度复核,细菌内毒素标准溶液制备图示：,内毒素检查专题知识专家讲座,第13页,鲎试剂灵敏度复核,待复核鲎试剂准备,取规格为,0.1ml/,支鲎试剂,18,支，每支加入,0.1ml,检验用水使溶解备用（规格大于,0.1ml,支鲎试剂，按其标示量加入细菌内毒素检验用水复溶后按,0.1ml/,管分装到凝聚管中，最少准备,18,管）。,加样,将已充分溶解待复核鲎试剂,18,支（管）放在试管架上，排成,5,列，其中,4,列,4,支，,1,列,2,支。其中,4,支,4,列分别加入,0.1ml,2,、,、,0.5,和,0.25,内毒素标准溶液；另,2,支（管）加入,0.1ml,检验用水作为阴性对照。,内毒素检查专题知识专家讲座,第14页,鲎试剂灵敏度复核,加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂直放入,371,恒温器中，保温,602,分钟。,结果观察,将试管轻轻取出，缓缓倒转,180,，若管内形成凝胶，而且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。,阳性,阴性,内毒素检查专题知识专家讲座,第15页,鲎试剂灵敏度复核,计算,当最大浓度,2,管均为阳性，最低浓度,0.25,管均为阴性，阴性对照为阴性时试验为有效，按下式计算反应终点浓度几何平均值即为鲎试剂灵敏度复核结果。,c=lg-1,（,X/4,）,式中,X,为反应终点浓度对数值（,lg,）。,反应终点浓度是指系列递减内毒素浓度中最终一个呈阳性结果浓度。,内毒素检查专题知识专家讲座,第16页,鲎试剂灵敏度复核,例子：,结果判断,当,c,在,0.5,2,（包含,0.5,和,2,）时，方可用于细菌内毒素检验，并以标示灵敏度,为该批鲎试剂灵敏度。,内毒素检查专题知识专家讲座,第17页,干扰试验,目标,确定供试品在多大稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检验法提供依据。,当进行新药内毒素检验试验前，或无内毒素检验项品种建立内毒素检验法时，须进行干扰试验。,当鲎试剂、供试品配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果改变时，须进行干扰试验。,内毒素检查专题知识专家讲座,第18页,干扰试验,进行干扰试验普通步骤,供试品限值确定,依据鲎试剂灵敏度确定,MVD,范围,（供试品溶液浓度范围）,预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度,正式干扰试验,干扰试验预试验,目标,初步确定供试品最大不干扰浓度（当限值以,EU/mg,或,EU/U,活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以,EU/ml,表示），为正式干扰试验提供依据,防止干扰试验盲目性,。,内毒素检查专题知识专家讲座,第19页,干扰试验,操作方法,1,、将无可检测到内毒素供试品进行一系列倍数稀释，但最大稀释倍数不得超出,MVD=CL/0.03,（,0.03EU/ml,为现今我国市售鲎试剂最高灵敏度）。,2,、使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做,2,支供试品管和,2,支供试品阳性对照（即该浓度供试品稀释液将内毒素标准品制成,2,浓度）。另取,2,支细菌内毒素检验用水作阴性对照，,2,支加入,2,浓度内毒素标准溶液作为阳性对照。,例 制备稀释倍数为,4,供试品阳性对照溶液：,0.3ml4.0EU/ml,内毒素标准液,+0.3ml,稀释倍数为,2,供试品稀释液,0.6ml,含,2EU/ml,内毒素标准液稀释倍数为,4,供试品稀释液,3,、保温,602,分钟，观察并统计结果。,内毒素检查专题知识专家讲座,第20页,干扰试验,4,、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验有效。当系列浓度中出现供试品溶液,2,管为阴性，供试品阳性对照,2,管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。,5,、当系列浓度中全部浓度供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释倍数（不得超出,MVD=CL/0.03,），或经过其它适宜方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。,6,、当供试品内毒素限值单位为,EU/mg,或,EU/U,活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即稀释倍数下溶液浓度），以,mg/ml,或活性单位,/ml,表示。,内毒素检查专题知识专家讲座,第21页,干扰试验,举例,某注射液限值为,2.5EU/ml,，按,MVD,CL/,计算出灵敏度为,0.03EU/ml,下,MVD,为,83,倍，将供试品溶液进行一系列稀释，用灵敏度为,0.25 EU/ml,鲎试剂预试验，结果以下：,稀释倍数,原液,5,10,20,40,80,供试品溶液,供试品阳性对照,+,+,+,由以上结果可初步确定该样品最小不干扰稀释倍数为,20,倍，可在此浓度下进行正式干扰试验。,内毒素检查专题知识专家讲座,第22页,干扰试验,正式干扰试验,制备内毒素标准对照溶液,取,1,支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检验用水稀释成,4,个浓度标准溶液即,2,、,、,0.5,、,0.25,。,制备含内毒素供试品溶液,将供试品稀释至预试验中确定不干扰稀释倍数，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成,4,个浓度即,2,、,、,0.5,、,0.25,含内毒素供试品溶液。,鲎试剂准备,取规格为,0.1ml/,支鲎试剂,36,支，备用。,内毒素检查专题知识专家讲座,第23页,干扰试验,加样,准备好,36,支鲎试剂放在试管架上，按下列图加样。,0.1ml,内毒素标准液,0.1ml,检验用水,0.1ml,含内毒素供试品液,0.1ml,供试品液,加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，防止产生气泡，放入,371,恒温器中，保温,602,分钟，观察并统计结果。,内毒素检查专题知识专家讲座,第24页,干扰试验,试验结果计算,如两组最大浓度,2.0,均为阳性，最低浓度,0.25,均为阴性，阴性对照,4,管均为阴性时，按下式计算用检验用水制成内毒素标准溶液反应终点浓度几何平均值（,Es,）和用供试品溶液或稀释液