高效液相色谱故障排除1

Mastertitelformat bearbeiten,Mastertextformat bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,探索色谱新领域，默克与您共同努力！,2002-9,液相色谱仪和色谱柱故障排除,故障排除,发现问题,定位问题,纠正问题,防止问题的再发生,主要规则,故障特征,1.,色谱峰展宽,2.,压力升高,螺丝、金属箍、毛细管,相应的对策,1.用配套的螺丝、金属箍和毛细管,2.,连接进样器和色谱柱之间的管道,(柱外死体积)应尽可能地短,螺丝、金属箍和毛细管故障,死体积,连接螺丝包括一个螺母和一个套在毛细管上的金属箍；它们必须和完全匹配,当完全匹配时，毛细管的顶端将和仪器或柱子的端口恰好吻合，而不至于形成死体积,死体积会导致出现肩峰和双重峰,注意：,不同生产厂家的螺丝和金属箍是不能通用的。,螺丝、金属箍、毛细管,毛细管,1.从泵到检测器所有毛细连接中，毛细管的内径应逐渐减小。,(,如泵-进样器连接用内径为,0.5,mm,的毛细管；进样器-柱子以及柱子-检测器连接,用,0.2,mm,的毛细管),3.大内径的毛细管导致宽峰,4.太长的管子导致峰的分辨率差，特别是换用微径柱时,2.在使用微径柱(3,mm,或2,mm,),或梯度解吸时，选择合适内径和合适长度的毛细管尤为重要,注意：,使用短的和内径小的毛细管可以将和毛细管有关的柱外体积,效应降到最低,螺丝、金属箍、毛细管,流动相的准备,1.,使用,色谱纯,的,溶剂,和,优级纯,的,试剂,2.,用,S&S,公司的,0.45,m,的滤膜将所用的溶剂和缓冲溶液过滤,3.,使用,HPLC,级(或梯度级)的溶剂(如,MERCK,的,溶剂事先都经过过滤),4.,使用醋酸盐缓冲溶液比使用磷酸盐缓冲溶液要好，但应注意醋酸盐缓 冲液在近紫外区的吸收,5.,使用酸或碱准备缓冲溶液要比使用盐好,6.,使用,0.04%,的叠氮钠溶液以防止流动相长菌,溶剂,流动相脱气,使用不脱气或脱气不完全的流动相会导致形成气泡、泵性能不稳定、检测器噪音高以及其它检测器故障,注意：1.加热是流动相脱气的最好方,法，但不方便,2.,氦气脱气也很方便，仅需几,分钟就可以完成,3.,真空过滤脱气效果较差，但,很方便，也很经济，不失为,一常规办法,溶剂,溶剂纯度的影响,溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是梯度解吸时,注意：,只能使用色谱级的溶剂,!,不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液,溶剂,溶剂混合产生的问题,流动相中所使用的不同溶剂必须互溶,注意：,过高浓度的磷酸盐缓冲溶液可能会在有机溶剂中析出,流动相中溶剂不互溶会导致:,1.基线漂移，,2.保留时间的重现性差，,3.出现肩峰和,“,鬼峰,”,的问题,.,溶剂,样品的溶解,样品应该溶解于流动相中，如果样品在流动相中的溶解性实在太差，则应将进样体积降到很低,(,如,1,l),选用不合适的溶剂溶解样品可能会导致,保留时间的重现性差，肩峰、双重峰和,“,鬼峰,”,溶剂,缓冲溶液和离子对系统,1.应保持缓冲溶液的浓度在,20,mM,到,50,mM,之间，以获得最佳的分析结果,2.浓度过低的缓冲溶液体系会导致峰形差，分辨率低,3.一种缓冲溶液的最有效的缓冲,pH,范围是偏离其,pKa,值,1,pH,单位,不同缓冲体系的缓冲范围,缓冲溶液种类,pKa,缓冲范围,磷酸盐,2,.1 1.1-3.1,7.2 6.2-8.2,12.311.3-13.3,醋酸盐,4.8 3.8-5.8,柠檬酸盐,3.1 2.1-4.1,4.7 3.7-5.7,5.4 4.4-6.4,溶剂,故障特征,“,鬼峰,”,(,由已被污染的过滤头造成,),保留时间不断改变,(,由于过滤头堵塞或部分堵塞,),清洗步骤,：,1.,水,2.,稀硝酸,3.,水,4.,异丙醇,5.,水,(,超声波清洗,),流动相过滤头产生的问题,溶剂,进样体积,进样量过大会导致峰形不对称以及保留时间变短的问题,通常引起色谱柱过载或超出检测器的检测限是由于样品浓度过高而不是体积的问题,过大的进样体积会导致产生宽峰,注意：,使用微径柱时，必须保,证柱子不要过载,进样,Sample size effects,Sample amount,1 g/g silicaok,10 g/g silicaprobably ok,100 g/g silicaoverloaded;,ok for preparative LC,进样-色谱柱过载,获得高重现性结果的要求,各,批次之间的重现性好,每根柱子之间的重现性好,峰形对称,分离效率高，选择性好,色谱柱故障的原因,柱子的寿命,63,%,反压升高,23,%,重现性变差,18%,分离效率降低,12%,色谱柱,避免问题的“秘诀”,使用,预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）,大多数反相色谱柱的,pH,稳定范围是,2-8.0,避免流动相组成及极性的剧烈变化,流动相使用前必须经脱气和过滤处理,如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保 存在乙腈中,压力升高是需要更换预柱的信号,色谱柱,非极性固定相,(如反相色谱填料,RP-18,RP-8,等,)的再生：,水,乙腈,氯仿,(,或异丙醇,),乙腈,水,0.05,M,稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱,色谱柱的再生,直接,将色谱柱连接到泵，每种清洗溶剂用20倍柱体积,极性固定相,(如,Si,NH2,CN,DIOL,基色谱填料)的再生：,正庚烷,氯仿,乙酸乙酯,丙酮,乙醇,水,注意：在通常情况下，最好是更换色谱柱；花费太多的时间用于色谱柱再生而不能,保证正常的分析工作是得不偿失的。,色谱柱,柱外死体积,柱头的死体积会导致产生双重峰或脱尾峰,而且，已被污染的预柱或柱子滤网也会导致产生类似的问题,色谱柱,色谱柱,(,压力)问题,当色谱柱连接到泵,将柱子反向冲洗；,和进样器时，压力,柱头滤网堵塞 更换滤网；,特别高,更换色谱柱,柱头填料变脏,将柱子反向冲洗；,取下滤网，挖去柱头变脏的填料，填入新的填料；,更换色谱柱,当柱子连接到检测,器时,压力很高,柱子和检测器之间,停泵,!(危险：检测池可能会堵塞),的管道堵塞,更换管子,可能原因 解决办法,压力高,没有出峰;,峰高改变,解决问题,可能原因 解决办法,预柱堵塞 更换预柱,柱头堵塞 更换柱头的滤网；反向冲洗柱子；,更换色谱柱,毛细管堵塞 更换毛细管,可能原因,泵没有开流速；系统有漏,进样体积或浓度的重现性差,解决办法,检查泵；检查接头；检查流动相的组成；,检查系统是否有漏,检查进样系统以及样品的均匀性,噪音高或基线漂移,解决问题,可能原因,柱子没有平衡好,杂质组分从色谱柱中缓慢流出,杂质在柱子中的富集,检测器或色谱柱的温度差异,系统有气泡,检测器氘灯需更换,电压不稳造成干扰,解决办法,继续冲洗色谱柱至平衡,利用强极性的溶剂冲洗色谱柱,冲洗色谱柱；改进和提高样品的预处理；,使用液相色谱纯的溶剂,使用色谱柱恒温箱,流动相脱气；使用反压调节器,更换氘灯（氘灯使用寿命一般为1000小时）,使用稳压电源；检查供电系统,出现,“,鬼峰,”,解决问题,可能原因,上一针样品中没有完全流出的物质,样品中未知的组分,色谱柱被污染,溶剂中有杂质,流动相和溶解样品的溶剂不互溶,三氟乙酸被氧化,解决办法,待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个样品；,每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；,改进样品的预处理；组分复杂的样品尽可能使用,梯度解吸的方法,改进样品的预处理,每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；,改进样品的预处理,使用色谱纯的溶剂,尽可能用流动相溶解样品,流动相尽量每天新配；使用三氟乙酸时，应,使用抗氧剂,出现肩峰或,前延峰,解决问题,可能原因,预柱被污染或选用了不合适的预柱,柱头,“,塌陷,”,造成死体积或是,柱子内部有短流出现,溶解样品的溶剂选择错误,干扰物质的存在；样品中的杂质,色谱柱过载,柱外效应的影响,解决办法,更换预柱,更换色谱柱,用流动相溶解样品，如果不可以，应将,进样体积降至很低（如1微升）,改进样品预处理；用测试的混合物,检验色谱柱；使用色谱纯溶剂,将样品稀释,检查毛细管连接,峰形展宽,解决问题,解决办法,更换色谱柱或预柱,减少进样体积；稀释样品,用流动相溶解样品,使用浓度稍高的缓冲溶液或者,换用其它的缓冲溶液,检查毛细管连接,检查是否有漏；使用小的检测池,提高色谱柱温度,使用内径较细的较短的毛细管连接；,检查柱外死体积,使用较小粒径填料的色谱柱；,更换色谱柱,可能原因,色谱柱或预柱被污染或不合适,色谱柱,“,过载,”,或进样体积过大,溶解样品的溶剂选用不当,缓冲溶液的浓度太稀,柱外效应的影响,色谱柱和检测器之间有漏；,检测器的检测池过大,色谱柱温度太低；,流动相的黏度太高,连接用的毛细管太长；,柱外死体积太大,色谱柱柱效下降,出现脱尾峰,解决问题,解决办法,减少样品体积；,增大色谱柱内径；,使用高容量的固定相,改进样品预处理；,调节流动相的组成；,使用测试样品混合物检查色谱柱；,使用色谱纯溶剂,使用流动相改性剂（如三乙胺）；,提高缓冲溶液或盐溶液的浓度（离子对色谱）,降低流动相的,pH,值；,使用碱性去活的色谱柱,更换滤网；使用柱前过滤系统；,将样品过滤,检查毛细管连接,更换色谱柱；,使用性质较温和的分离条件,可能原因,色谱柱过载,干扰峰；杂质,硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响,色谱柱的滤网堵塞,柱外效应的影响；,死体积,色谱柱有,“,塌陷,”,、短流或断流,出现双重峰或,分叉峰,解决问题,可能原因,样品体积过大；,色谱柱过载,溶解样品的溶剂选用不当,色谱柱有,“,塌陷,”,、短流或断流,色谱柱滤网堵塞,进样器没有彻底清洗,解决办法,减少进样体积；,稀释样品；,将样品在流动相中溶解；如果不行，,尽可能将进样体积降低（如1微升）,更换色谱柱；,使用较温和的分离条件,更换色谱柱的滤网；,使用柱前过滤装置；,过滤样品,彻底清洗进样器；,更换进样器转子,保留时间变长,解决问题,可能原因,流速降低,硅胶表面有活性点,键合相流失,流动相的组成有变化,温度降低,解决办法,检查系统是否有漏；,更换泵的密封圈；,排净气泡；,使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；,使用碱性去活的色谱柱,保持流动相,pH,值在2-7.5 范围内,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用色谱柱恒温箱,保留时间缩短,解决问题,可能原因,流速升高,色谱柱过载,键合相流失,流动相组成发生变化,温度升高,色谱柱老化,解决办法,检查泵；检查流速,降低样品的浓度或进样体积,流动相的,pH,值保持在2-7.5 范围内,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用色谱柱恒温箱,更换色谱柱；,使用预柱,保留时间,无规则改变,解决问题,可能原因,流速发生变化,色谱柱尚未平衡；,缓冲溶液容量不够,流动相组成发生变化；,流动相中的溶剂互溶性差,色谱柱温度发生变化,杂质在色谱柱中,“,堆积,”,解决办法,检查是否有漏；,更换泵的密封；,排净气泡,至少用10倍柱体积的流动相平衡色谱柱；,使用的缓冲溶液浓度应保持在,20,mM,至,50,mM,之间,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用色谱柱恒温箱,冲洗色谱柱；,出现,选择性差异,解决问题,可能原因,流动相组成发生变化,流动相的强度太小,溶解样品的溶剂选用不当,色谱柱的寿命已到；,色谱柱被污染,温度发生变化,色谱柱之间的重现性有差异,（如不同生产厂家的柱子）,解决办法,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用缓冲溶液和离子对系统,将样品在流动相中溶解；如果不行，,尽可能将进样体积降低（如1微升）,更换色谱柱；,改进样品预处理；,使用测试样品混合物检查色谱柱；,使用色谱纯溶剂,使用色谱柱恒温箱,更换色谱柱，同时检查色谱柱的生产厂家,避免问题,确定问题所在！,将处理问题的时间降到最低,预测可能出现的问题,一次仅改变一种因素,!,确保同样的问题发生过至少两次,!,尽量预计下