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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,1.1,、原理,电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带静电荷的多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。蛋白质分子在外加电场下的泳动行为可用下列函数式表示：,EQ,V=,6,r,v,：,分子泳动速度,Q,：,分子所带净电荷,E,：,电场强度,r,：,分子半径,：,介质粘度,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基磺酸钠（,SDS,），,则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量的大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,SDS,是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和,分子团的混合形式存在。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象，特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原，从而保证了蛋白质分子与,SDS,能充分结合，形成带负电荷的蛋白质,-SDS,复合物。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,这种复合物由于结合了大量的,SDS,，,使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。,SDS,与蛋白质结合后，还会引起蛋白质分子发生构,象的改变，使蛋白质复合物在水溶液中的形状近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质,-SDS,复合物的短轴长度都一样，约为,1.8nm,，,长轴则随蛋白质分子量成正比变化。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,这样的蛋白质,-SDS,复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。,当蛋白质的分子量在,15000200000D,之间时，蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下列方程式：,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,lgM,w,=-b,m,R,+K,M,w,：,蛋白质的分子量,m,R,：,相对迁移率,b,：,斜率,K,：,截距,当条件一定时，,b,，,K,均为常数，即此时,lgM,w,与,m,R,的关系为线性关系，,如以,lgM,w,对,m,R,作图，应,得到一条直线，如右图：,lgM,w,m,R,待测,m,R,待测,lgMw,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,如将已知分子量的几种标准蛋白质的相对迁移率对分子量作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得该蛋白质的分子量。,电泳用的支持介质为凝胶，常用的有聚丙烯酰胺凝胶,(PAGE),和琼脂糖凝胶（,agarose,）。,本试验用聚丙烯酰胺凝胶。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单体，,Acr,）和甲叉双丙烯酰胺（双体，,Bis,）在催化剂（,TEMED,）和引发剂（,AP,或,VitB,2,）作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。,单体和双体单独存在或混合在一起都是相对稳定的，若有自由基存在则可引发二者的聚合。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,自由基引发的方式有化学法和光化学法两种，前者的引发剂是过硫酸胺（,AP,），后者的引发剂是核黄素（,VitB,2,）。两种方法的催化剂都是四甲基乙二胺（,TEMED,）。,在一定浓度范围内，改变聚合体系中,Acr,和,Bis,的比例，可得到不同网眼大小的凝胶，由于凝胶的三维网状结构，对在凝胶中泳动的不同分子量的质点有着选择和阻碍，因此使凝胶本身又具有分子筛效应。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续和不连续系统两种，不连续电泳系统是采用两种不同的缓冲液配制两种不同浓度的凝胶，它可使样品在两层胶的界面处浓缩，从而大达提高了电泳的分辨率，使之特别适用于稀样品的分离。,聚丙烯酰胺凝胶电泳法的特点：简便、快速、重复性好，只需几微克的样品即可进行测定。当分子量范围在,15000200000D,时，所测得的结果与用其它方法测得的结果相比，误差一般不超过,10%,。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,1.2,、材料与试剂,1,、试验材料,新鲜植物叶片（大蒜、菠菜、韭菜）,2,、试验试剂,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,标准蛋白质,名称 分子量（,10,4,D,）,-,半乳糖苷酶,11.60,牛血清白蛋白,6.62,鸡卵清蛋白,4.50,乳酸脱氢酶,3.50,核酸内切酶抑制剂,2.50,-,乳球蛋白,1.84,鸡蛋清溶菌酶,1.44,其它试剂及使用时的注意事项参见,P67,。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,1.3,、操作方法,1,、凝胶的制备,试剂名称,12%,分离胶,4%,浓缩胶,30.8%,胶母液,3 ml 0.35ml,Tris-HCl,(pH 8.9)0.9 ml,Tris-HCl,(pH 6.7)0.3 ml,10%SDS 75,ul,25ul,TEMED,（,原液）,4,ul,5,ul,H,2,O 3.5 ml 2.3 ml,10%,过硫酸铵（,AP,）,60,ul,25,ul,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,2,、样品的提取及处理,、样品的提取,取新鲜叶片，冲洗干净，吸干表面水分，去掉叶脉，称取去脉叶片,0.5g,，,加入,0.05mol/L pH7.8,的磷酸缓冲液,2ml,，,加石英砂少许研磨成匀浆，,10000r/min,离心,10min,，,上清备用。,、样品的处理,取,30ul,待测样品的上清于离心管中，加入,30ul,浓样品溶解液，混匀，置于,100,水浴中保温,35min,，,取出冷却备用。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,若待测样品浓度太稀应事先浓缩；若样品盐浓度太高则需先行透析，再进行上述处理。,其它操作步骤及注意事项解说详见,P68,。,1.4,、实验结果及处理,用直尺分别量出染料的迁移距离和各样品区带的迁移距离，如图所示：,按下列公式计算相对迁移率,m,R,：,0,加样,浓缩胶,染料迁移距离,样品迁移距离,染料位置,电泳方向,分离胶,样品迁移距离（,cm,）,染料迁移距离（,cm,）,相对迁移率,m,R,=,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，绘制标准曲线。并根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。,
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