冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,冰冻切片制作与染色,过程中,常见的,问题,夏春梅,1,问题思考,组织是否,足够新鲜,？,1w,以内？,灌注固定液、洗液,PH,值、离子浓度,是否合适？,一抗是,选择途径，滴度,如何确定的？,是否阅读过,DATASHEET,?,保存，有效期，,reactivity,Cross-Reactivity,？,对该,蛋白表达和分布,有无,预期,的估计和了解,?,是否设了,阳性和阴性对照,？,是否排除了,自发荧光,？,是不是,判读,正确？,2,一、,冰冻切片的优缺点,优点：,简便，快速，用时短,可以,不需要对组织固定、脱水、透明、包埋,组织变化不大,能很好保存脂肪，类脂,能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类,对,有机溶剂或热的温度耐受能力较差,的,细胞膜表面抗原,和,水解酶,保存较好。,缺点：,不容易,做,连续,切片,组织不能过大,-,不容易冻结或者组织冻结不均,不容易,制作,较薄,的切片,冻结过程中容易产生,水的结晶,而影响细胞的形态结构及,抗原物质的定位,组织结构不如石蜡切片清晰,，但是满足科研的要求,针对其缺点要注意操作,条件优化,，避免错误,3,二、切片制作过程中几个关键步骤,1.,动物,取材,2.,组织,固定,3.,切片,制作,4.,切片,染色,好的切片制作和染色成功的关键,细节决定成败,固定、漂洗溶液,PH,值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特异性；切片孵育时间，湿度、温度；,切片判读正确,-,反映真实的科学现象,知识结构背景,组织学结构的熟悉,认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增生、凋亡,审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度,4,常规,HE,染色,特殊染色,如：,Masson(Thichrome staining),，油红,O,，尼氏染色，台盼蓝（肥大细胞）染色,免疫染色,(immunol staining),免疫荧光,(immunol fluorescence),免疫组化,(immunol histochemistry),依据科学研究的需要选择方法,5,1.,动物取材：一定要注意“,平行性”,1 Control,6 Control,2 Control,3 Control,4 Control,5 Control,1 sham,6 sham,2 sham,3 sham,4 sham,5 sham,1 I/R,6 I/R,2 I/R,3 I/R,4 I/R,5 I/R,1 I/R+treatment,2 I/R+treatment,3 I/R+treatment,4 I/R+treatment,5 I/R+treatment,6 I/R+treatment,预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量,减少不同组间,baseline,的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，环境条件对染色影响）,发表、修改文章图的一致性,横向,纵向,横向“,block,”,6,举例：不同实验时间和条件下同种一染色方法结果差异,A B C,Masson staining,7,2.,标本固定应充分,固定的标准,切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰,一般较多采用,组织固定后再行切片,浸入法和灌注法,浸入法,：,活检,、,手术标本，不能进行灌注的组织固定,灌注法,：,动物实验研究,固定剂种类,：,醛类、非醛类、丙酮及醇类,中性缓冲液配制多种聚甲醛,较为常用,组织固定时,固定液要有,足够的量,(,固定液是组织体积的,8-10,倍,),保持一定时间,，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定,2-4h,（,4,冰箱）,8,减少冰晶的形成,公认：,未经固定的组织,切片,冰晶较多,固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，为防止冰晶的形成,采取如下方法,速冻法,：将组织置入低温环境，使组织骤然降温,利用高渗溶液吸收组织,水,分子,：将组织置于20%30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够时间,（多长时间,?,判定？）,9,3.,切片,：组织,新鲜非陈旧标本,是成败首要因素,低温恒冷箱,冰冻切片法,组织快速冷冻到一定的硬度,(,机器要,预冷,),选择不同的冷冻度,根据不同的组织而定,未经固定的脑组织,、,肝组织,：,-10-15左右,甲状腺、脾、肾、肌肉等组织,：,-1520,含,脂肪组织，-25左右,含大量的脂肪,-30,10,保持切片的完整性,切片破碎不全、有缺损的,常见原因,固定不完全,温度设置不当,组织,块过冷、过硬,，则切片就容易破碎,组织块,冷冻不够,，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎,组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多,切片,刀钝或较脏,，切片出现刮痕，使切片不完整,操作手法不当，如速度不适宜,11,防止切片卷缩,常见原因,切片刀钝或粘有组织碎屑,防卷板位置不正确或防卷板较脏,静电或者气流作用,防卷板温度高、室温高,采取对策：,保持防卷板,干净、平整、无缺损、无刮伤,戴口罩,，以避免呼出的气流直接吹到防卷板,切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室盖，,降低防卷板温度,12,贴片中常见问题及处理,载玻片粘不上切片,准备的载玻片温度过低,将载玻片置于常温即可,贴片时切片易碎,排除固定不充分等因素外,贴片时应注意动作轻、稳、准,根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔,根本的解决方法：多观察，多练习，,熟能生巧,13,贴片方式及标记,载玻片上标记（铅笔）,组织类型,时间,组别,检测抗原类型,同一载玻片上,包括各个所有组,染色齐性,L1 DRG,Con.TNBS,LY ZD7288,TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,L1 DRG,Con.TNBS,LY ZD7288,TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,L1 DRG,Con.TNBS,LY ZD7288,TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,L1 DRG,Con.TNBS,LY ZD7288,TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,1,2,3,4,14,4.,染色：抗体孵育和选择,:,免疫组化,最关键环节,试剂公司提供标准化的试剂,附,详细的试剂说明书（,datasheet,，特别强调！）,包括抗体的,来源,免疫球蛋白的,亚类,单抗或多抗,交叉,反应,使用,稀释度,使用流程和注意事项,洗涤时缓冲液的,适宜离子强度,和,PH,值,等,15,抗体分装和保存,购入的抗体,分装在多个安瓿中,根据月需要量，大致每安瓿含,520,微升,立即,放置低温冰箱内贮存,（,-20,以下）,长期保存在,4,冰箱内会失效,避免反复冻融,抗体效价急剧下降而失效,16,工作抗体的确定,确定对于所要研究抗原的最敏感抗体,已出版的文献,作为参考资料,(IHC,和,WB,抗体要注意区别,),阳性切片,进行预试验,检测抗体的,最佳工作浓度,了解哪些组织表达这些抗原,有助于确定阳性染色，特别是当细胞表达水平低时尤为重要,17,三、免疫组化结果分析,免疫组化结果的判断原则：,1.,必须设对照,2.,抗原表达,必须在特定部位,3.,阴性结果不能视为抗原不表达,18,1.,实验分析的相关介绍,阳性对照：,用,已知抗原阳性的切片,与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。,对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。,19,用,确证不含已知抗原的标本,作对照，应呈阴性结果，称阴性对照,阴性对照还应包括,空白对照：,用,PBS,替代第一抗体,替代对照：,用与第一抗体来源的同一,动物前血清,，来替代第一抗体,吸收实验：,用,过量的已知相应的纯化抗原,与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应,抑制实验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的特异性抗体染色,阴性对照：,20,阳性对照,阴性对照,替代对照,实验 组,结论,1,操作错误,2,非特异性反应,3,阴性对照含定位,Ag,4,阴性对照不含定位,Ag,5,受检组织非特异性染色,6,受检组织不含定位,Ag,7,受检组织含定位,Ag,2.,免疫组化染色实验组与对照组结果分析表,21,只有,6,，,7,实验结果有意义,1,5,均因对照组的结果已,否定,Ab,的特异性,或因,IHC,技术操作存在错误,等而使实验结果失去意义,必须重复实验或换用,Ab,阳性对照,阴性对照,替代对照,实验 组,结论,6,受检组织不含定位,Ag,7,受检组织含定位,Ag,22,阳性染色特点,定位,：胞浆、胞核、胞膜、间质有,结构性,染色,强度不同,：颜色深浅不一,非特异性染色,细胞与组织,无区别,弥散性均匀,3.,综合评价特异性阳性染色：,23,优秀免疫组化切片,:,信噪比高,A B C,假阳性示范图,*,弥漫棕色,或,单一黄色,的细胞染色可能是非特异性的,25,4.,染色失败的几种表现：,(1),所染的全部切片,均为阴性,结,果，包括阳性对照在内。,染色失败,(2),所有切片均,呈阳性反应,(3),所有切片,背景过深,(4),阳性对照,染色,良好,，检测的,阳性标本,呈,阴性,反应,26,(1),所有切片呈阴性,1,）染色未完全严格按照操作步骤进行,2,）漏加一种抗体，或抗体失活,3,）,缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性,4,）,底物中所加,H,2,O,2,量少或失活,5,）,复染或脱水剂使用不当,27,切片在染色过程中,抗体过浓,，或,干片,了。,缓冲液,PH,值,不准确，,洗涤不彻底,。,使用,已变色的显色底物,溶液，或显色反应时间过长。,抗体,温育,的,时间过长,。,H,2,O,2,浓度过高，显色速度过快且,粘,附剂太厚,。,（,2,）所有切片呈阳性反应，其原因：,28,（,3,）,所有切片背景过深,内源性过氧化酶没有完全阻断,切片或涂片过厚,漂洗不够,底物呈色反应过久,蛋白质封闭不够或所用血清溶血,使用全血清抗体稀释不够,29,（,4,）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。,最常见的原因是：,标本,的,固定,和,处理不当,30,最后一个细节：,PBS,洗液的,PH,和离子强度,建议,PH,在，浓度是,0.01M,中性及弱硷性条件,（,PH=7-8,）有利于免疫复合物的形成,酸性条件则有利于分解,低离子强度,有利于免疫复合物的形成,高离子强度则有利于分解,31,谢 谢！,32,