基因工程菌的发酵课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十四章,基因工程菌的发酵,第一节 工程菌的来源和应用,一、何谓基因工程,基因工程,（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。,基因工程的核心技术是DNA的重组技术。,重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。,除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。,二、工程菌的获得,确定目的产物。,找出产该产物的细胞。,将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。,利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。,将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。,将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。,三、工程菌应具备的条件,发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。,菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。,菌株不是致病株，也不产内毒素。,代谢控制容易进行。,能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。,四、工程菌的应用,1，基因药物,红细胞生成素,胰岛素,干优素,乙肝疫苗,生长激素,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,2，其它发酵产品,酶制剂,氨基酸（苏氨酸、色氨酸）,抗生素,一、安全问题,关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。,物理密封,是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。,生物学密封,要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。,三、工程菌的培养,工程菌的营养控制,质粒稳定性,重组质粒拷贝数的控制及表达效率,1，底物浓度的控制,在基因工程茵培养过程，至少要遵循P,I,级物理防护的规定，因此必需进行菌体的高密度培养。,从生物安全性考虑，培养的基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。,2，质粒稳定性,（1）质粒不稳定的类型,分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。,结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。,（2）影响质粒稳定的因素,与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响,宿主对质粒稳定的影响,质粒拷贝数,重组质粒的表达对质粒稳定性的影响,（3）使质粒稳定的措施,组建合适载体,选择适当宿主,施加选择压力,抗生素添加法,抗生素依赖变异法,营养缺陷型法,控制基因过量表达,控制培养条件,假定在分批培养过程中，细胞在对数生长期每次分裂时，其质粒丢失率为P，则F,n,为,3，表达效率及质粒拷贝数控制,在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。,在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。,所以,对于底物,对于产物,第四节 培养装置与产物的提取,工程菌的培养与普通微生物的培养方法类似。在进行以工业化为目的的DNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌时，当然应采用简便易行的培养系统。现在多半使用大肠杆菌为宿主，而在一般的通气搅拌罐中大肠杆菌能生长良好。,二、工程菌外漏的防范,首先应了解培养微生物在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有：,排气，,机械密封，,接种，,取样，,培养后的灭菌(通入湿热蒸气)，,排液(输至下一工序)。,1，排气,2，机械密封,考虑培养液外漏的情况，培养基因工程菌时，以用上部搅拌的双机械密封为好。,4，培养后的灭菌,培养后对培养液和管道等进行灭菌时，一开始流出的末灭菌排水有可能存在活的重组菌。取样、排液的管道中能产生这类排水，因此，一定要另行安装排水管并与废液灭菌贮槽等相连接，以便排放污水。,5，接种,向罐内直接接种的方法是不安全的。简单的安全接种法是将种子瓶与培养罐以管相连接后，用无菌空气加压压入的方法。另一种方法是先把种子液在安全柜内移至供接种用的小罐内，再将其与培养罐连接，用蒸汽对连接部分灭菌后，把种子罐中的种子液接入培养罐内。,6，排液,培养后要将培养液输送至贮罐等下一道工序，这时也有可能产生气溶胶和重组菌的扩散。安全的方法是在培养开始前就将排液口与下段工序相连接并进行灭菌，这样培养一结束即可直接输送培养液。如果排液口未与下段工序相连那就应与连结废液灭菌罐的排水管道相接，这样就安全了。,三、培养罐的管道布局,下图表示重组菌培养罐(P2、P3级)的整体流程图。重组菌培养罐中，凡有可能外漏重组菌的部分都与排污管道相连。图中所示的管路能分离并排出污染重组菌的污水。,四、基因工程产品的提取和精制,传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在下列两方面：,传统发酵产品多为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高，提取方法较简单)，其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因此放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。,基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。,另外，对于基因工程产品，还应注意生物安全(biosafety)问题，即要防止菌体扩散，特别对前面几步操作，一般要求在密封的环境下操作。例如用密封操作的离心机进行菌体分离时，整个机器处在密闭状态，在排气口装有一无菌过滤器，同时有一根空气回路以帮助平衡在排放固体时系统的压力，无菌过滤器用来排放过量的气体和空气，但不会使微生物排放到系统外。,