课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段(精品)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/6/1,#,专题,5 DNA,和蛋白质技术,课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片断,分子生物学研究中最强大的实验技术之一,其本质是在体外模拟胞内,DNA,分子复制的过程,美国科学家穆利斯,(K.B.Mullis),发明了,PCR,技术,1993,年诺贝尔奖,.DNA,分子的结构,C,、,H,、,O,、,N,、,P,1.,元素组成：,脱氧核苷酸,2.,基本单位,:,一,.,基础知识,脱氧核苷酸,脱氧核苷,磷酸,脱氧核糖,含氮碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤（,A,）,鸟嘌呤（,G,）,胞嘧啶（,C,）,胸腺嘧啶（,T,）,一个核苷酸上的,磷酸基团上的“,OH”,和,另一个核苷酸分子的第,3,位碳原子上的羟基,之间失去一分子水，形成,磷酸二酯键，,即在,相邻的,两个脱氧核苷酸的,3,和,5,碳原子,之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过,3,、,5,、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。,通常将,DNA,的,羟基“,OH”,末端称为,3,端，而磷酸基团的末端称为,5,端,3.,多脱氧核苷酸链得形成,多脱氧核苷酸链结构简图,4.,DNA,分子的双螺旋结构,.DNA,分子是由,的（即一条链为,3,5,，另一条链为,5,3,）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则,结构。,.,与,交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；,排列在链的内侧。,.,两条链上的碱基通过,连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与,配对，,一定同胞嘧啶配对。,双螺旋,两条反向平行,脱氧核糖,磷酸,碱基,氢键,胸腺嘧啶,鸟嘌呤,.DNA,的复制,2.,时期,有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。,3.,场所,细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。,1.,概念,由一个,DNA,形成两个完全相同的,DNA,的过程。,4.,基本条件,酶,:,解旋酶、,DNA,聚合酶,能量,:ATP,原料,:,四种脱氧核苷酸,模板,:DNA,的两条链,.,边解旋边复制,(,过程）,5.,复制特点,.,半保留复制（结果）,6.,遵循原则：,碱基互补配对原则,7.,精确复制的原因,8.,复制的意义,DNA,分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性,规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行,参与的组分,在,DNA,复制中的作用,解旋酶,DNA,母链,4,种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,引物,总结：胞内,DNA,复制的基本体系,打开,DNA,双链,提供,DNA,复制的模板,合成子链的原料,催化合成,DNA,子链,使,DNA,聚合酶能够从引物的,3,端开始连接脱氧核苷酸,.,PCR(,多聚酶链式反应）,2.DNA,聚合酶特性,不能从头合成,DNA,，只能从,DNA,的,3,端开始延伸,DNA,链，因此，,DNA,复制需要引物。,3.DNA,聚合酶作用过程,当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从引物的,3,端开始延伸,DNA,链，,DNA,的合成方向,总是从子链的,5,端向,3,端延伸。,1.,定义：,是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术。能以极少量的,DNA,为模板，在几小时内复制出上百万份的,DNA,拷贝。,4.PCR,原理,.,在,80,100C,的温度范围内，,DNA,的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。,.,当温度缓慢降低后，两条彼此分离的,DNA,链又会重新结合成双链。,.PCR,利用了,DNA,的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的,PCR,仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。,高温解决了打开双链的问题，但是，又导致,DNA,聚合酶失活的问题，耐高温的,Taq DNA,聚合酶解决了高温导致,DNA,聚合酶失活的问题，促成了,PCR,技术的自动化。,5.Taq DNA,聚合酶的应用,6.,需要为,PCR,反应提供的物质,缓冲液,、,DNA,模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的,DNA,聚合酶，同时通过控制温度使,DNA,复制在体外反复进行。,PCR,技术是,80,年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。,7.PCR,技术的特点：,8.,细胞内和细胞外,DNA,复制环境的区别,体内,DNA,的复制,PCR,模板,(,母链,),引物,原料,:dNTP,聚合酶,反应环境,细胞内源,引物合成酶,细胞内的环境,细胞内源,细胞内源,外源加入,缓冲液,外源加入,外源加入,外源加入,.PCR,过程需要的引物不是,RNA,，而是人工合成的,DNA,单链，其长度通常为,20,30,个脱氧核苷酸,9.,细胞内复制和,PCR,不同点,.PCR,过程中,DNA,的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的,10.PCR,的重要应用：,广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和,DNA,序列测定等。,1,、,PCR,仪,.,设备及用具,实质上一台能够,自动调控温度,的仪器。,二,.PCR,的实验操作,2,、微量离心管,一种,薄壁塑料管,，总容积为,0.5ml,3,、微量移液器,用于,定量转移,PCR,配方中的,液体，,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,1.,准备,2.,移液,.,实验操作步骤,按照,PCR,反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。,用微量移液器按照,PCR,反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。,混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。,3.,混合,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约,10s,。,4.,离心,离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。,将离心管放入,PCR,仪上，设置好,PCR,仪的循环程序。,5.,反应,循环数,变性,复性,延伸,第一次,94,，,10min,30,次,94,，,30s,55,，,30s,72,，,1min,最后一次,94,，,1min,55,，,30s,72,，,1min,PCR,一般经历,三十多次,循环，每次循环可以分为三个基本步骤,变性、复性和延伸,.,.,变性（模板,DNA,解旋）,模板,DNA,经加热至,90,0,C,以上。一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。,.,复性（退火）,模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降到,50,0,C,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合。,.,延伸,DNA,模板引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的,DNA,链。,靶序列,靶序列,PCR,循环第一步：高温变性,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR,循环第二步：引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA,聚合酶,PCR,循环第三步：引物延伸,靶序列,靶序列,第,1,个,PCR,循环完成后：得到两个靶序列,PCR,技术,高度灵敏，,为了避免外源,DNA,等因素的污染而造成干扰实验，,PCR,操作时要注意做到：,6.,注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,.,理论上,DNA,扩增数目的计算,三,.,课题成果评价,1.,一条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,2,n,2.a,条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,a2,n,.,实验中,DNA,含量的测定,1.,原理,可以通过计算,DNA,含量来评价扩增的效果，,DNA,在,260nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与,DNA,的含量有关。,2.,过程,.,稀释,2uLPCR,反应液，加入,98uL,蒸馏水，即将样品进行,50,倍稀释,.,.,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长,260nm,处，将紫外分光光度计的读数调节至零。,取,DNA,稀释液,100uL,至比色杯中，测定,260nm,处的光吸收值,.,计算,.,计算,DNA,含量,(,g,),50(260nm,的读数,),稀释倍数,50,：,1,g,/ml,的,DNA,在厚度为,1cm,比色杯中的吸光值为,0.02,光吸收,波长,nm,260,240,220,280,0.1,0.2,比色杯,四,.,课题延伸,例如：,PCR,产物每轮循环增加一倍，,30,轮循环扩增量达,2,30,个拷贝（,10,9,拷贝）,PCR,技术是,80,年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点,五,.,实验小结,PCR,仪加热使（）变性,复性使引物与模板,DNA,（）,延伸需将反应温度升至中温,(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过,30,次循环,最终使基因放大了数百万倍,;,将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的,DNA,带。,模板,互补,Taq,聚合酶,四种脱氧核苷酸,引物,变性、复性和延伸,72,