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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,薄层色谱法,(TLC),一、薄层色谱法的概述,（一）平面色谱法的概念,平面色谱法,是将固定相涂布于平面载板上，流动相借,毛细管作用,流经固定相，使被分离后的物质保留在固定相上的一种色谱方法。,薄层色谱法,是将被分离物质点在将固定相,均匀涂布,于,玻璃板,、,铝箔,或,塑料片,上形成的薄层上而进行分离的。,纸色谱,薄层色谱,平面色谱,薄层色谱,高效液相色谱,色谱系统,开放式,闭路,展开方式,展开,洗脱,流速控制,吸附剂的毛细管作用,由泵调节,平衡时间,短,不定,分析样品,可同时分析多个样品,每次一个样品,样品量,高,低,板高（,m,）,30,25,有效板数,600,5000,检测方式,静态,动态,溶剂用量,少,多,溶剂更换,易,难,固定相,一次弃去,反复使用,（二）薄层色谱与高效液相色谱的比较,二、薄层色谱法的技术参数,薄层色谱,保留值,表示方式有：比移值（,R,f,),比移值,是溶质移动距离与流动相移动距离之比，是薄层色谱的基本,定性,参数。,薄层色谱法的技术参数包括,分配系数与容量因子,，,理论塔板数与塔板高度,，,分离度,，,保留值等,。,当,R,f,=0,时，表示组分留在原点,未被展开,；当,R,f,=1,时，表示组分随展开剂至前沿，即组分不被固定相吸附，所以,R,f,值只能在,01,之间。通常,R,f,值在,0.20.8,之间较适宜。,高比移值（,hR,f,=100R,f,）,三、薄层色谱法的基本操作,薄层板的准备,点样,展开,定位,定性与定量,样品处理,铺制薄层板可用的固定相有：,硅胶,、,氧化铝,、,纤维素,、聚酰胺、葡聚糖凝胶等，其中薄层色谱法用的固定相,90%,以上,的分离工作都可用,硅胶,。,为了使薄层牢固地附着在支持体上便于操作，需要时还要在固定相中加入合适的,粘合剂,；为了特殊的分离或检出需要，有时也需在固定相中加入某些,添加剂,。,（一）薄层板,制备薄层板的载板包括有：玻璃板、塑料片和铝箔。,（,1,）硅胶,普通硅胶,和,改性硅胶,两种类型。,1,、固定相,普通硅胶,硅胶为多孔性无定形粉末，表面有硅醇基成弱酸性（,pH=4.5),，通过硅原子上的,-OH,基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而表现其吸附性能。有效的硅醇基数目越多，其吸附能力越强。,改性硅胶,改性硅胶是借化学反应的方法，将有机分子以,共价键,连接在硅胶的,硅醇基,上，因此称为,化学键合固定相,。按键合有机硅烷的官能团分为,极性键合相,及,非极性键合相,。,硅胶的分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。,键合有机分子中含有某种极性基团，和普通硅胶比，吸附活性降低。,键合相表面都是极性很小的烃基，最常用的就是十八烷基键合硅胶。,（,2,）氧化铝 用氧化铝可分离萜类、生物碱类、脂肪类及芳香族化合物，因制备方法和处理方法的差别，氧化铝有弱碱性（,pH=910),、酸性,(pH=45),及中性,(pH=77.5),之分，因此其使用范围也有所不同。它在薄层色谱法中的应用范围仅次于硅胶。,（,3,）其他固定相,纤维素,按其用途不同分为,普通纤维素,（天然纤维素、高纯度纤维素、微晶纤维素）、,乙酰化纤维素,和,离子交换纤维素,。,另外还包括,聚酰胺,，葡聚糖凝胶（亲水性葡聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离子交换剂）和硅藻土等,固定相,。,2,、粘合剂及添加剂,（,1,）粘合剂,理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强且具有,化学惰性,。,常用粘合剂有：,煅石膏,(CaSO4),、,羧甲基纤维素钠,(CMC-Na),、淀粉；预制板的粘合剂包括有聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丙烯酰胺等高聚物。,（,2,）添加剂,为了特殊需要可在制备薄层时加入某些添加剂制备成具有特殊性能的薄层。包括有,荧光指示剂,，酸、碱或缓冲液，硝酸银溶液和其他。,带有荧光指示剂的,薄层在,紫外灯,下整个薄层呈现,荧光,，被分离化合物的斑点处的荧光被,猝灭,而呈,暗色,。,吸附剂及预制板包装上部分符号及含义,符号,含义,G,以石膏作粘合剂,H,无外加粘合剂,R,特别纯化的,P,制备用,W,水可湿性的,254,365,荧光指示剂激发波长,F254s,抗酸性荧光指示剂,40,60,.,平均孔径,3,、薄层板的制备方法,薄层板包括有,预制板,和,手工制板,两种。,（,1,）预制板 预制板使用,方便,，涂布,均匀,，薄层,光滑,及有很好的牢度，预制板有用玻璃板，塑料片或铝箔作为载板，使薄层附着在上面，塑料片或铝箔的预制板还有裁剪方便的优点。常用于薄层,定量,。,（,2,）手工制板,手工制板一般分为,不含粘合剂的软板,及,含粘合剂的硬板,两种。,手工制板所用的玻璃板一般为,5cm20cm,，,10cm20cm,或,20cm20cm,的,2mm,厚的玻璃板，要求,板面平整,，,洗净,后排列在薄层板放置架上备用。,软板是将吸附剂直接于玻璃板上用干法涂成均匀的薄层即可使用，但软板疏松，操作不方便，因此目前很少使用，主要用硬板。,洗净的玻璃板用,乙醇,擦拭干净，挥干乙醇后，用手动或自动涂布器（最好用自动涂布器）将已调制好的固定相,均匀,地涂铺在玻璃板上，涂布后的薄层板应,水平放置,，,室温阴干,备用。,制备薄层板时的注意事项,（,1,）必须先要制备固定相匀浆，由于固定相及粘合剂类型不同，性能也不同，匀浆时加水量也不同。匀浆搅拌时应朝,同一个方向,进行，以减少气泡的产生。,（,2,）涂布时速度,要快,，避免固定相过度凝固给涂布带来困难，涂布速度要求,均匀,，涂布后的薄层,晾干时应在阴凉的地方,，避免因通风而导致层面产生裂纹；应保持,水平放置,。,（,3,）定性定量时用的薄层固定相厚度为,0.20.3mm,，制备薄层的厚度要求约,0.52mm,。,4,、薄层板的活化,手工制的硅胶或氧化铝薄层板，涂布晾干后有时必须经过,活化才能使用,。,薄层分离物质与吸附剂表面及其孔隙表面的活性点的,强度,和,数目,有关。活性点的强度及数目较大时，吸附剂的活度就高，吸附剂的保留能力也较高，不同物质在吸附剂上被吸附的能力不同，则可以彼此分离。,薄层板活化的原因,薄层活度大小受,大气相对湿度,的影响，吸附剂表面能,可逆,地吸收水分。如果大气湿度过大，薄层活度过低，对分离效果会产生影响。为了提高薄层活度则必须将室温晾干的薄层板在,点样前,根据活度要求在一定温度下活化。一般晾干后的薄层板在,105120,条件下干燥,0.51h,。,（二）点样,在点样前，应将薄层板在日光或紫外光下检查板面有无损坏或污染。,点样时通常使用,点样针,和,毛细管,进行点样。,毛细管规格,(mm),：内径,0.1,、,0.2,、,0.3,、,0.4,、,0.5,长度,100,。,注意：点样时点样针或毛细管不能划破载板上的固定相。,点状点样：,原点直径,5mm,，一般为,3mm,（经典薄层）和,12mm,（高效薄层）。,带状点样：,展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。,常用的点样方式：,点状点样,和,带状点样,。,1.,原点直径过大会降低分辨率及分离度；尽可能,避免多次点样,。,2.,点样量：经典薄层一般为,15ul,，高效薄层为,100500nl,，,总量不要超载,。,3.,点样速度尽可能快，耗时尽可能短。,注意：,硅胶的硅醇基以氢键的形式,优先吸附水,，吸水速度,很快,，因此应用预先经过,活化,的薄层板。在点样时也会立即吸附空气中的水蒸气，因此在点样时可用干净的玻璃板,盖住,活化的薄层板，,只留出原点区域以便点样,。,几种不同点样方式的比较,A.,长,560mm,，内径为,0.20.05mm,的熔融石英管；,B.,微量注射器，机械控制，接触板面点样；,C.,同,B,，用步进马达控制操作；,D.,同,B,，完全用计算机控制点样。,A,B,C,D,方式,优点,缺点,A,价廉,精密度差,B,很精密,需要仪器,C,很精密,仪器复杂,D,很精密,仪器很复杂,（三）展开,点样后的薄层需置,密闭,并,加有展开剂,的展开室中进行展开，样品与展开剂及固定相之间相互作用的结果使样品中各成分沿展开剂流动的方向被分开。,1,、展开室,双槽展开室,平底展开室,平面色谱的展开有三种几何形式即,线性,、,环形,及,向心,。其中最常用的有,线性展开,和,多次展开,。,（,a,）、（,b,）为线性，（,c,）为环形，（,d,）为向心,2,、展开方式,线性展开：,上行展开,、下行展开、,双向展开,、,近水平展开,、水平展开。,近水平展开,上行展开,溶剂蒸发面积大，展开时易饱和,展开速度快,展开溶剂用量大,溶剂易浸没点样点,3,、展开剂,展开剂又可称为溶剂系统、流动相或洗脱剂，是在平面色谱法中用作流动相的液体。理想的展开剂分离样品得到的,R,f,值应在,0.20.8,之间。,（,1,）溶剂的分类,展开剂是由,单一或混合溶剂,组成的，因此溶剂的性质是溶剂分类的基础，溶剂分类是确定展开剂组成的基础。,溶剂分成,6,类：第,类为,电子授受体溶剂,；第,类为,质子给予体溶剂,；第,类为,强质子给予体溶剂,；第,类为,质子受体溶剂,；第,类为,偶极作用力溶剂,；第,类为,惰性溶剂,（即非极性溶剂）。,（,2,）溶剂强度,溶剂强度是指单一溶剂或混合溶剂洗脱某种溶质的能力。在,正相,色谱中，它,随溶剂极性的增加而增大,；在,反相,色谱中则,相反,。溶剂强度大的溶剂洗脱能力强。,常用溶剂洗脱顺序（由弱到强）：四氯化碳（,1.7,），甲苯（,2.3,），氯仿（,4.4,），乙腈（,6.2,），乙酸乙酯（,4.3,），丙酮（,5.4,），乙醇（,5.2,），甲醇（,6.6,），水（,9.0,）。,展开剂的选择方法：,三角形法,。根据展开剂、固定相及被分离物质三者间的相互影响，三者的关系如下：,极性,展开剂,非极性,亲水性,样品,亲脂性,固定相,失活性,活性,展开剂选择的步骤：,薄层展开时展开剂的,量不能太少也不能太多,，太少被分离物质不能分离，太多则会淹没点样点，使被分离物从薄层板上脱离而溶于展开剂中。,第二：进一步提高展开剂的选择性，即使样品中各组分有合适的分离度。对于未知混合物，则要求分离斑点数越多越好。,第一：选择一种合适的溶剂强度的展开剂，使样品中各组分多落在最佳或至少是可用,R,f,范围内。,4,、影响薄层展开的因素,（,1,）,相对湿度的影响,水蒸气与吸附剂之间有很大的亲和力，即使是微量的水蒸气对色谱分离结果也会产生较大的影响。,（,2,）溶剂蒸气的影响,平面色谱分离过程是固定相、流动相和气相共同作用的结果。在展开时展开室的饱和对分离有明显的影响。溶剂蒸气得不到饱和易引起,“,边缘效应,”,。,产生边缘效应时，只需用展开剂将,展开室及薄层板饱和后,再展开就可以消除。,饱和对展开影响很大，因此对展开室的饱和及对薄层的预平衡非常重要。,此外，展开时展开室的,密闭,也很重要。,（,3,）温度的影响,展开时环境的温度对薄层色谱的展开影响很小。通常在室温下进行展开。,（,4,）展开方式的影响,不同的展开方式，不同的展开条件对平面色谱的分离效果有明显的影响。,（,5,）展距的影响,常规薄层展距为,1020cm,，高效薄层为,510cm,。,（,6,）展开室的放置
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