味精的生产工艺

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,味精的制作,一 实验目的,1掌握谷氨酸发酵的原理及发酵过程的控制和操作,2掌握培养基的配制和灭菌的基本技术、谷氨酸菌种制备及种 子扩大培养。,3了解用等电法从发酵液回收谷氨酸的方法。,4掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。,二 实验原理,味精,也称味素,因味精起源于小麦,俗称,麸酸钠、谷氨酸钠,（分子式C,5,H,8,NO,4,Na）。,谷氨酸是由谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为原料生产的一种呈味氨基酸，其代谢机理为：葡萄糖经糖酵解（EMP）和单磷酸己糖途径（HMP）生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定作用生成草酰乙酸，两者合成柠檬酸进入三羧酸循环（TCA循环），由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。由于谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型突变株，要在培养基中添加亚适量（浓度应在5,g/L左右）生物素维持细胞正常生长和控制细胞膜的透性达到高产谷氨酸的目的。回收的谷氨酸又称麸酸，并无鲜味，将其进行中和精制得到味精。,等电点法提取谷氨酸原理,谷氨酸具有两性电解质性质，溶于水呈离子状态，解离方式取决于溶液pH，在不同pH溶液中，谷氨酸可解离成GA+、GA、GA-和GA2+四种不同离子状态。谷氨酸等电点是3.22，故当溶液的pH为3.2时，溶液中大部分是GA两性离子，,其分子内部正负电荷相等,并含有等量的带不同电荷的阳离子(GA,+,)和阴离子(GA,-,),因此溶液中总静电荷等于零。由于谷氨酸分子之间相互碰撞,再通过静电引力的作用,结合成较大的聚合体而被沉淀析出,因而处于,等电点时GA的溶解度最小,。谷氨酸在不同条件下结晶，会形成两种不同晶形，一种为型斜方晶体，颗粒大，容易结晶析出，纯度高；一种为型鳞片状结晶，比重轻，不宜沉淀分离，往往夹有杂质与胶体结合，浮于液面或母液中，纯度低。等点操作中应尽量控制型晶体的形成。,又由于温度对GA的溶解度影响很大,温度越低溶解度越小,生产上多采用04,。,三 实验用品,一）仪器：试管、三角烧瓶、纱布、吸管、接种环、试管、烧杯、752（7200）分光光度计、高压灭菌锅、电子天平、超静工作台、10L自动发酵罐、高压灭菌锅、生化培养箱、摇床、旋转蒸发仪等,二）菌种,谷氨酸棒杆菌,（实验室提供）,三）培养基,1.,斜面培养基（g/L）,酵母粉 0.5，蛋白胨 1，氯化钠 0.5，pH 7.0,121灭菌30min,2,种子培养基（g/L）：,葡萄糖 25，玉米浆 30（2330），MgSO4 0.5，,K2HPO4 1.5,，,MnSO,4,0.02，FeSO,4,0.02，,尿素 5。pH值7.07.2,121灭菌30min,3发酵培养基（g/L）：,葡萄糖 140、糖蜜 2.0（,玉米浆6,）Na2HPO4 1.0，KCl 1.2，MgSO4 0.8，MnSO4 0.02，FeSO4 0.02，VB1 0.2mg，pH 7.07.2。,4补料溶液：,葡萄糖600g/L，质量分数40%尿素（氨水 25%）,5消泡剂0.01%（消泡剂配制后经灭菌、冷却后备用),四 实验内容,（,一）工艺流程,原料的预处理及淀粉水解糖的制取,谷氨酸生产菌种子的扩大培养谷氨酸发酵谷氨酸的提取与分离由谷氨酸制成味精及味精成品加工,（二）实验步骤,1,斜面菌种制备,：接种针挑取1环原始菌种，于斜面培养基划线，在恒温培养箱32 培养18-24h。,2,液体种子培养,：接一环生长良好的斜面种子至装有50ml种子培养基的500ml三角瓶（,1000ml装200-250ml）,，放在冲程为8cm的往复式摇瓶柜上培养，转速为 96rmin，温度 32，培养8-9h。,一级种子质量标准：,pH 6.5 光密度 OD0.75以上 残糖0.5%以下,镜检：菌体生长均匀、粗壮，革兰氏阳性，,无杂菌，八字形占95%以上,由于发酵罐的容积较小，所以省略了二级种子的培养。,3-1,发酵培养,发酵罐培养,1培养基配制,按发酵培养基配制，用自来水定容至发酵罐容积的60%，pH调至7.0-7.2。,2）灭菌,空消及空气过滤系统灭菌,灭菌前检查发酵罐及相关管路气密性，121灭菌30min，灭菌过程打开各路排气阀门，空气过滤系统灭菌后通压缩空气吹干备用。(罐小，可省略),2）实消,发酵罐加入培养基后，通过夹套预热至80，直接通蒸汽灭菌，121灭菌20min，再关闭蒸汽，改用自来水冷却至32。灭菌完毕通无菌空气保持罐内正压，防止染菌。,3）发酵工艺条件,采用,火焰接种法接种,，接种量,10%,罐压,控制在,0.05MPa,转速,200750r/min,，调节转速及通气量控制,溶氧在,20%,以上,当,pH,降到,7.07.1,左右，,及,时流加尿素（氨水）,。前期,pH,7.5,8.0,，中期降到,7.17.4,，后期,7.0,，在发酵结束前,6,小时停止流加尿素（,氨水）,，接近放罐时,pH,约,6.56.8,温度：,0-5h 34,；,5-10h 35,；,10-18h 36,；,18h26h 37,；,26h,后,37,OD,净增控制,:,总,OD=0.75,0.8,。,残糖浓度通过流加葡萄糖液（,残糖在,5%2.0%,时是流加糖最佳时机,）控制在,10-15g/L,。发酵周期在,36h,内，放罐时残糖应低于,5g/L,。流加糖占总投糖的,60%70%,时产酸和转化率较为理想。开始流加时机应以残糖量、耗糖速度、菌体的活力和转型情况为依据,泡沫控制,：在发酵产生一定泡沫时，流加一定量的消泡剂，每次流加约,40g/m3,。,4）放罐,发酵结束后，将发酵液加热至80维持15min灭菌，并清洗发酵罐及补料瓶。,从发酵4小时开始，每间隔2小时测定OD，pH，糖含量，镜检,3-2,发酵培养,摇瓶发酵,取种子培养液以,10%接种量,接种至装有,25mL发酵培养基,的500mL三角瓶中，8层纱布封口，置巡回式摇床(220r/min)上振荡培养 36h。添加 2滴1%苯酚红指示剂，间歇流40加尿素控制 pH 在 7.0 左右。温度：前期3233，后期3437 。转速：前期100rmin，后期220r/min。,发酵过程参数测定幻灯片 9,还原糖的测定,谷氨酸的测定,菌体形态观察,菌体浓度测定,发酵过程参数的控制,DO值,pH,温度,搅拌速度,发 酵,发 酵 液,冷却接种,三角瓶培养,固体斜面培养,上罐实消,培养基的配制,谷氨酸发酵的工艺流程简图,6,谷氨酸的提取与分离等电点法提取工艺,操作简单，收率60。周期长，占地面积大,晶种,4h,发酵液菌体分离清液（浓缩）育晶点停酸搅拌两小时边冷却边缓慢调酸,2M HCL,等电点低速,搅拌,结晶68h 4静置沉降4h湿谷氨酸离心分离谷氨酸,母液,1)发酵液预处理,采用金属过滤膜过滤设备去除菌体及固形物杂质，必要时可在膜过滤前添加絮凝剂沉淀蛋白质杂质，添加发酵液体积1.5%的粉末活性炭在80下对发酵液脱色20min，在510nm下透光值达到75%以上。,2）发酵液浓缩,采用旋转蒸发仪70、-0.1 MPa真空度下浓缩发酵液体积至原体积的50%。,3）等点结晶,采用2M HCL调节谷氨酸浓缩液pH至3.2，并缓慢搅拌育晶8h,4）晶体分离及干燥,采用真空抽滤设备分离谷氨酸晶体，60烘干并称重。,7 谷氨酸制味精,谷氨酸用适量的NaCO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤、最终制成味精。,工艺条件：湿谷氨酸：水：纯碱：活性炭=1：2：（0。30.34）：0.01,1）在不锈钢内桶内加入清水及活性炭升温到65,，开始搅拌60r/min。投入谷氨酸，,成为饱和溶液。,2）缓慢逐步加入,NaCO3 中和到pH6.4（试纸），,加热到65，继续搅拌,4）谷氨酸钠的浓缩结晶：a.将澄清的脱色液（18-20B/35 ）加到旋转式蒸发仪（加料1/2）,真空度80kPa以上，T70 浓缩至3434.5 B/80，升温至80 放料。放料后冷却，搅拌23h后开冷却水降温，降温到（室温+15 ）b.分离：抽滤（工业滤布作介质/真空抽滤设备,）,c.烘干：鼓风干燥箱（T60 ）干燥。即可得到味精原粉。,注 中和液,除铁、除锌,：硫化钠法、树脂法除铁锌。,五 注意事项,1菌种制备的整个过程牢固,无菌,概念，严防杂菌污染。,2流加糖消毒灭菌温度不宜过高，切要迅速降温至3045，105 在搅拌以防止糖液的焦化产生焦糖和色素,流加过程中残糖控制量不宜忽高忽低。,3等电点法提取谷氨酸注意A、发酵液纯度高：谷氨酸/残糖比值高，胶体少，提前除菌体最好；B、发酵液处理要及时；C、加酸调pH、温度、育晶时间、搅拌服从结晶规律，特别是观察到晶体后，要停搅拌2h 育晶，否则产物无法沉淀。D,谷氨酸结晶操作中要控制条件，,避免,型结晶析出。,4中和使用,NaCO3，在pH7左右得到谷氨酸一钠，在pH9-10得到的是谷氨酸二钠，因此中和应严格控制反应的pH。,5注意配料顺序：硫酸镁和磷酸氢二钾应分别溶解，交叉加入,六实验数据处理方法,1）菌体OD,：,吸取0.5ml发酵液，加入9.5ml水稀释并摇匀，采用7200分光光度计于600nm下（752型620nm）测定吸光值。,2）,pH值:,在线测定,3）,还原糖,含量:用裴林试剂测定,4）,镜检,：每隔6小时检测菌体的生长状况，要求无杂菌和噬菌体。,5）,GA含量：,从发酵12小时开始，每隔4小时测定,GA含量,，GA用,茚三酮比色法,测定。,6）糖酸转化率,发酵液中生成的谷氨酸量和消耗的葡萄糖质量的比例。转化率=VtGA%/V0初糖%(Vt 发酵放罐体积;V0 初始定容体积),七实验结果分析,1 实验过程中每间隔2h取样一次，分别测定还原糖、溶氧、通气量、PH、菌体浓度、谷氨酸含量等指标的过程曲线，绘制谷氨酸发酵过程曲线图，并解释曲线变化的原因。,2、计算谷氨酸产量、糖酸转化率、谷氨酸提取收率等指标；,以发酵零小时的投入糖量除以发酵终了的谷氨酸总质量，得到谷氨酸的转化率。,3比较各小组实验结果，评价本小组谷氨酸发酵及味精制作的结果，总结实验过程中的得与失。,4根据所得产量，分析影响味精产量的因素。,八 思考题,1为什么以尿素为氮源的发酵控制中，增加风量和提高溶氧会造成发酵液PH的上升？,2以谷氨酸发酵过程中pH值的变化规律为例，说明为什么pH值的变化是反应过程中菌体生长和产物合成的综合性指标？,3发酵过程实现高的产酸，应如何防止杂菌及噬菌体感染？,主要参考文献,发酵工程实验指导 吴根福 主编 高等教育出版社 2006.5ISBN7-04-018619-5,生物工程专业实验 贾世儒 主编 中国轻工业出版社 2004.7 ISBN7-5019-4390-7,固定化原生质体半连续发酵生产谷氨酸 文章编号0254-5071（2010）06-0121-02,缪静 冯志彬 呈显好 张玉香 程仕伟 张健勇,Intnert,谢谢！,缓冲 溶 液 的 制 备:配 制p H 6.0 的NaAc-HAc 缓冲溶液。,谷氨酸标准液的配制:用天平准确称取1.0000g谷氨酸标准品,溶于 1L 缓冲溶液中。,再采用逐级稀释法配得浓度为 80 g/mL、90 g/mL至140 g/mL 的谷氨酸标准液。,茚三酮试剂的制备:称取 0.5g 茚三酮溶于 100mL 水中得到 5g/L 的茚三酮水溶液。,1 实验方法,2 标准曲线的确定,分别吸取 80140g/mL 的谷氨酸标准液 5mL 于 25mL 的比色管中,各加入 1mL,的茚三酮试剂,加上塞充分摇匀。将其置于90 下水浴 2025 min,冷却至室温,用,7200 型分光光度计在 569nm 下测得其光密度值2。以标准液的光密度值和浓度做一标,准曲线。,3 样品的测定,稀释待测液于 80140g/mL 内(谷氨酸发酵液浓度一般在 8%14%,测量时稀释1000 倍即可),调p H 为6.0。以同样的反应量与反应条件进行反应,并在 569nm 下测定其光密度