课题3　血红蛋白的提取和分离(精品)(精品)

*,. . .,*,. . .,*,. . .,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,专题,5 DNA,和蛋白质技术,课题,3,血红蛋白的提取和分离,一、基础知识,蛋白质提取与分离的依据,蛋白质的各种差异,1.,分子的形状、大小,2.,电荷性质和多少,3.,溶解度,4.,吸附性质,5.,对其他分子亲和力,1.,方法及原理,各种分子,带电性质,的差异以及,分子本身大小、形状,的不同,电泳法,根据,相对分子质量的大小,分离蛋白质,凝胶色谱法,原理,方法,血红蛋白的提取和分离,凝胶色谱法,1,.,概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,性质：微小的多孔球体,本质：多糖类化合物,实例：葡聚糖、琼脂糖,2.,原理：当,相对分子质量不同,的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量,较小,的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，,移动速度较慢,；而相对分子质量,较大,的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，,移动速度较快,。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,相对,分子质量,大,小,直径大小,大于,凝胶颗粒孔道直径,小于,凝胶颗粒孔道直径,运动路径,被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过,因扩散进入凝胶,颗粒内部而被滞留,运动速度,较快,较慢,运动路程,较短,较长,洗脱次序,先,后,缓冲溶液,1,、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液,pH,发生明显变化的溶液。,2,、作用：,能够抵制外界的酸或碱的对溶液的,pH,的影响，维持,pH,基本不变。,3,、配制：通常由,1,2,种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同,pH,范围内使用的缓冲液。,（,1,）还记得人体血液中的缓冲液吗？,H,2,CO,3,/NaHCO,3,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,（,2,）你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？,本实验使用的是,磷酸缓冲液,，目的是利用缓冲液模拟细胞内的,pH,环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察,（,红色,）,和科学研究,（,活性,）。,1,、概念：,指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2,、原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的,pH,下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的,差异,以及分子本身的,大小、形状,的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,电泳,3,、类型：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,在测定蛋白质分子量时通常用,SDS,聚丙稀酰胺凝胶电泳,应用：,测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定,原理：,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,：,消除净电荷对迁移率的影响。,二、实验操作实验步骤,1.,红 细 胞,洗 涤,2.,血红蛋白,释放,3.,分离,血红蛋白,4.,透析,血红蛋白,样品处理,和粗分离,纯 化,纯度鉴定,血红蛋白的组成,血红素基因,可携带一分子,O,2,或一分子,CO,2,水分,血浆,固体物质,血液,白细胞,血细胞 血小板,红细胞,血红蛋白（,90,）,1.,红细胞的洗涤,阅读思考：洗涤的,目的,是什么？洗涤的,方法,是什么？,洗涤干净的,标志,是什么？,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，,直至上清液没有黄色,洗涤的目的：,除去杂蛋白（血浆蛋白）,2.,血红蛋白的释放,阅读思考：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？,为了加速释放过程，采取了什么措施？,分析：,蒸馏水,的作用是,_,。,加入,甲苯,的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,红细胞破裂，释放出血红蛋白。,滤纸,过滤,分离脂类物质和红细胞破碎物沉淀层,3.,分离血红蛋白,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,烧杯,有机溶剂,血红蛋白,有机溶剂（甲苯层）,脂类物质（沉淀层，白色）,血红蛋白溶液（红色）,红细胞破碎物沉淀（暗红色）,分出血红蛋白,分液漏斗,20mmol/L,磷酸缓冲液,4.,透析血红蛋白,透析的目的是什么？,1mL,1mL,1mL,去除血红蛋白中的小分子杂质,透析袋？,磷酸缓冲液？,纯化,凝胶色谱操作,1.,凝胶色谱柱的制作：,2.,凝胶色谱柱的装填：,教材图,5,19,3.,样品的加入和洗脱,步骤,操作要求,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡,12h,（装填紧密）,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打（装填均匀）,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水,(,缓冲溶液）充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：,交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液,“,G,”,表示什么？,75,代表什么？,2.,凝胶色谱柱的装填,色谱柱内不能有,气泡,；装完后，立即用缓冲液洗涤，,平衡,凝胶使凝胶装填,紧密,。,3.,样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样,3.再调液面,4.洗脱,5.收集,缓冲液,凝胶,注意：,（,1,）加样不要破坏凝胶面；（,2,）用磷酸缓冲液洗脱；（,3,）连续收集,纯度鉴定,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,P69,1.,红细胞的洗涤：,A,、洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白,B,、离心速度过高和时间过长，使白细胞一同沉淀，达不到分离的效果。（低速短时离心）,2,.,色谱柱填料的处理：,凝胶颗粒放到洗脱液（蒸馏水）中充分溶胀。可用沸水浴加热，不但节约时间，还能除去微生物和排除空气。,3,.色谱柱的装填：,装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡（会搅乱洗脱的次序）；洗脱液不能断流。,4.,色谱柱成功标志：,红色区带均匀一致地移动。,操作提示：,结果分析与评价,血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出分离成功,血红蛋白的分离,放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖,2000,或红色葡聚糖，若,色带均匀、狭窄、平整装填成功,凝胶色谱柱的装填,分层明显样品处理完成,分层不明,显的原因,血液样品的处理,分析,项目,洗涤次数少，未能除去血浆蛋白,离心速度过高和时间过长,血红蛋白的提取和分离,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,1.,随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（ ）,A.,弄清各种蛋白质的空间结构,B.,弄清各种蛋白质的功能,C.,弄清各种蛋白质的合成过程,D.,获得高纯度的蛋白质,D,2.,使用,SDS-,聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（ ）,A.,电荷的多少,B.,分子的大小,C.,肽链的多少,D.,分子形状的差异,B,3.,用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（ ）,A.,相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子,质量较大的蛋白质,B.,相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子,质量较大的蛋白质,C.,相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子,质量较大的蛋白质,D.,二者根本无法比较,A,4.,在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（ ）,A.,调节,pH B.,维持红细胞的能量供应,C.,防止微生物生长,D.,防止血液凝固,D,6.,下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）,A.,可采集猪血作为实验材料,B.,用蒸馏水重复洗涤红细胞,C.,血红蛋白释放后应低速短时间离心,D.,洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,5.,一分子血红蛋白最多可携带的 O,2,分子数或者CO,2,分子数分别是,（ ）,A,.,4、2 B,.,4、4 C,.,2、1 D,.,1、1,B,A,