大肠杆菌感受态制备及转化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化,实验目的,1.,了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。,2.,学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。,3.,学习将外源质粒,DNA,转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。,实验原理,转化,( Transformation ),是将异源,DNA,分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。,转化中的受体细胞,转化过程所用的受体细胞一般是,限制性修饰系统缺陷的变异株,，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用,的变异株（,受体细胞,）有DH5,top10,JM109,等细胞,转化方法,：电击法、 CaCl,2,、 RuCl等化学试剂法,感受态细胞,：,经,处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。,转化细胞(转化子),：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。,实验原理,实验原理,本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl,2,处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pC,T74,质粒共保温，实现转化。 pC,T74,质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Ap,r,符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。,AmpR,抗,Amp,宿主细菌,含,Amp,培养基,影响转化率的因素,细胞生长状态和密度。,转化的质粒 DNA 的质量和浓度。,试剂的质量。,防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。,实验仪器,超净工作台,离心设备,台式高速冷冻离心机,恒温空气摇床,恒温培养箱,培养皿,实验试剂,大肠杆菌DH5,LB培养基，,0.1mol/LCaCl,2,溶液（预冷）,氨苄青霉素,p,C,T74,质粒,实验步骤,菌株活化,感受态细胞制备,外源,DNA,的转化,实验步骤,菌株活化,1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养,过夜,2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37,振荡,培养,过夜,3将培养液,以1：50-1：100的比例,转到100mlLB培养基中,振荡,培养,1,小时，到OD,600,0.30.4,实验步骤,感受态细胞制备,4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min,54000rpm离心5min,弃上清,6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl,2,轻轻,悬浮沉淀，,（注意：此时细胞很脆，不能剧烈振荡，以免细胞破裂）,冰上预冷10min,74000rpm离心5 min,弃上清,8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl,2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油 可70长期保存,实验步骤,转化,9 取目的DNA,（稀释好的pC,T74,质粒50,l,）,加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min,10于42水浴90S,11冰上放置2min,12加入800lLB液体培养基于37培养1小时,13将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上,14将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果,对照组,对照组,1,:,以同体积的,无菌双蒸水,代替,DNA,溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在,含抗生素的,LB,平板,上应没有菌落出现。,对照组,2,:,以同体积的,无菌双蒸水,代替,DNA,溶液,但涂板时只取,5l,菌液涂布于,不含抗生素的,LB,平板,上，此组正常情况下应产生大量菌落。,实验结果,实验报告,写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂,详细列出实验步骤；,将转化的实验结果拍照打印并贴到实验报告上。,