质粒DNA的提取与酶切鉴定

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验四,质粒,DNA,的提取与酶切鉴定,一,.,实验目的和要求,1,、,了解质粒,DNA,的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒,DNA,的方法；,2,、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；,通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。,二,.,实验原理,1,、碱裂解法小量制备质粒,DNA,：碱裂解法是基于线性大分子染色体,DNA,与小分子环形质粒,DNA,的变性复性的差异达到分离目的的，在,pH12.0,12.6,的碱性环境中，线型染色体,DNA,和环型质粒,DNA,氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒,DNA,由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将,pH,值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体,DNA,互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体,DNA,、不稳定的大分子,RNA,和蛋白质,-SDS,复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒,DNA,在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒,DNA,。,2,、限制性内切酶：,又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。,根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为,、,、,III,型三大类，,类和,III,类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖,ATP,的限制性内切酶活性。,类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的,DNA,。,类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故,类和,限制酶在基因工程中基本不用，,II,类酶在分子克隆中使用广泛。,其基本特点如下：,(1),、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如,EcoR,I,识别与切割序列为,5,GAATTC,3,3,CTTAAG,5,(2),、识别的核苷酸数目大多数为,4,6,个，少数识别,8,13,个；,(3),、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：,(4),、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如,Hpa,II,与,Msp,I,；有的识别位点不同，但对,DNA,切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如,BamH,I,与,Bgl,II,。,三实验材料与设备：,超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、,台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、,电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；,1.5mL,与,0.5mL,Eppendorf,管、,Tip,头,、烧杯、量筒,试剂：,LB,培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度,50-100mg,mL,；,溶液,I:50mmol/L,葡萄糖，,10mmol/L EDTA(pH8.0),，,25mmol/L,Tris-HCl,(pH8.0),；,溶液,II:0.2mol/L,NaOH,1%SDS(,现配现用,),；,溶液,III:,乙酸钾溶液,(3M,pH=4.8)(60mL,的,5mol/L,KAc,11.5ml,冰醋酸，,28.5mL H,2,O),；,RNase,A,：,10mg/ml,；,TE,缓冲液,:10mmol/L,，,Tris-HCl,1mmol/L,，,EDTA,，,pH8.0,；,5TBE,缓冲液：,0.45mol/L,Tris,硼酸，,0.01 mol/L EDTA,pH 8.0,；,10Loading buffer,：,1%SDS,0.05%,溴酚兰，,50,的甘油；,无水乙醇；,70,乙醇；,标准分子量片段；,核酸内切酶,E,coR,I(,TaKaRa,),；,E,coR,I,酶解缓冲液,(10 buffer H),；,琼脂糖；,溴化乙啶（,EB,）,染色液,(10mg/ml),。,四、碱裂解法小量制备质粒,DNA,1,、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，,37,震荡培养,12,16,小时；,2,、将,1.5mL,菌液加入,Ep,离心管中，,12000 g,离心,30 Sec,，,弃上清液，在吸水纸上扣干；,离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮,3,、加入,100,L,预冷的溶液,I,，,于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；,溶液,I,中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体,DNA,的断裂；,EDTA,的作用是与二价离子（,Ca,2,）,结合，降低,DNase,对,DNA,的降解,4,、加入,200,L,新配制的溶液,II,盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置,3,5min;,溶液,II,中的,NaOH,与,SDS,可裂解细胞，使,DNA,变性以及,SDS,使蛋白变性并形成交联的网状结构,5,、加入,150,l,溶液,III,加盖后颠倒,6-7,次混匀，冰上放置,2,3min,；,溶液,III,为低,pH,的醋酸钾缓冲液，中和,NaOH,，,以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体,DNA,不能正确复性,6,、,12000 g,离心,6 min,，将上清移入另一干净的,Ep,管中；,7,、加,2,倍上清体积,(,约,1mL),的无水乙醇,振荡混匀，室温放置,2min.,8,、,12000g,离心,10min,，弃上清液，再用,70,的乙醇洗涤一次，,12000g,离心,1min,，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；,9,、加入,40,L,含,50,g/mL RNase A,的灭菌蒸馏水或,TE,缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解,(,约,8min),，存于,20,或直接用于酶切。,质粒图谱,:,五、提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳,1,、在,1.5mL,Ep,管中依次加入下列溶液于,1.5ml,离心管中,提取质粒,DNA 4.0,L,10,buffer H 1.0,l,EcoR,I 1.0,l,（,2.0,U,）,dd,H2O 4.0,L,10,L,1U:1,单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，,在,20,L,反应液中反应,1h,，使,1,g DNA,完全消化所需的酶量,.,2,、轻轻混匀,4000g,离心,10,秒，置于,37,水浴中酶解,2-3h,。,3,、酶解完成后，电泳检测酶切结果。,六、,实验结果报告,1,、质粒浓度的计算（紫外分光光度计法）,紫外分光光度法测定核酸含量,双链,DNA,含量,=OD,260nm,样品稀释倍数,50ug,ml=ug/m1,样品,2,、质粒提取与酶切鉴定电泳结果，贴上打印实验照片并标明照片上各,DNA,条带的含义。,七、思考题,1,、根据,DNA,限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中,II,类限制性内切酶有何特性？,2,、在用碱裂解法小量制备质粒过程中,I,液、,II,液与,III,液的作用是什么？,