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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫诊断,Immunodiagnosis,免疫系 王巍,免疫诊断,(,Immune diagnosis),概念,利用免疫学原理进行临床疾病的诊断或辅助诊断,抗原抗体反应的高度特异性,-,亲和力,抗原抗体反应的可逆结合,-,解离度,抗原抗体反应需要合适的浓度和比例,-,可见性,抗原抗体反应的两个阶段：,（,1,）特异性,结合,-,非共价，肉眼不可见，几秒,-,几分钟,（,2,）可见性反应,-,电荷吸引，肉眼可见，数小时,-,数天,一、抗原或抗体的检测,（一）、抗原抗体反应的特点,抗原抗体比例合适,温度：,37,度,酸碱度：,pH 6-8,电解质：失去表面电荷,抗原抗体反应的影响因素：,（二）、检测抗原或抗体的方法,1.,凝集反应（,agglutination),：,颗粒性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块,直接凝集反应：,颗粒性抗原,+,相应抗体, ABO,血型测定,间接凝集反应：,可溶性抗原,+,颗粒载体,+,相应抗体,2.,沉淀反应,(precipitation),：,可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物,单向免疫扩散：可用于检测血清中,Ig,的含量,双向免疫扩散：抗原抗体的定性分析,免疫电泳：常用于血清蛋白种类分析,免疫比浊：,Ag Concentration,Diameter,2,Ag,Ag,Ag,Ag,Ab in gel,单向免疫扩散,双向免疫扩散,Ag,+,-,Ag,Ab,免 疫 电 泳,3.,用标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应,免疫荧光法,：,荧光素与抗体连接 荧光抗体,直接免疫荧光：荧光素标记的抗体直接作标本染色,间接免疫荧光：一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色,Ag,Y,Fluorochrome,Labeled Ab,Tissue Section,Ag,Y,Y,Fluorochrome,Labeled Anti-Ig,Tissue Section,Unlabeled,Ab,酶免疫测定：,酶标记抗体进行的抗原抗体反应,酶联免疫吸附试验,(ELISA),：,将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。,它将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。,双抗体夹心法 检测待测抗原,间接法 检测待测抗体,BAS-ELISA,（生物素,-,亲和素系统,-ELISA,）,酶联免疫斑点试验,(ELISPOT),免疫组化技术,放射免疫测定法（,radioimmunoassay, RIA,）：,放射性核素标记抗原或抗体，,131,I,、,125,I,化学发光免疫技术（,chemiluminescence immunoassay, CLIA,）：,化学发光物质,标记抗原或抗体，鲁米诺,免疫胶体金（,immunological colloidal gold signature, ICS,）：,胶体金颗粒标记抗原或抗体，氯金酸（,HAuCl,4,）,免疫印迹技术（,immunoblotting, western blotting,）：,十二烷基磺酸钠（,SDS,）聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）后转膜孵育一抗二抗,二、免疫细胞的测定,分析免疫细胞的数量和功能，评价病人的免疫功能包括,CD,分子测定、淋巴细胞转化、吞噬实验、细胞毒实验等,（一）、淋巴细胞的分离与类型鉴定,分离方法：密度梯度离心 单个核细胞,磁珠分离：抗体与磁珠交联,免疫吸附分离法：将已知抗体包被培养皿，加入淋巴细胞悬液,荧光激活细胞分选仪分离法（,FACS,）,抗原肽,-MHC,分子四聚体技术,磁珠分离法：,磁珠标记的抗体,流式细胞分选仪（,FACS,）,（二）、免疫细胞功能测定：,T,细胞功能测定,B,细胞功能测定,吞噬细胞功能测定,T,细胞功能测定：,T,细胞增殖试验,细胞毒试验,细胞因子检测,皮肤试验,3H-TdR,掺入法：,氚标记的胸腺嘧啶核苷，掺入新合成的,DNA,中，增殖越多,3H-TdR,掺入越多,2. MTT,法,3-,（,4,，,5-,二甲基,-2-,噻唑）,-2,，,5-,二苯基溴化四唑，被琥珀酸脱氢酶还原为紫褐色颗粒,细胞增殖的检测法：,细胞毒实验：,细胞形态：台盼蓝染色,51,Cr,的释放,LDH,释放,凋亡细胞检测法：,细胞形态：,琼脂糖电泳,:,DNA ladder band,FACS:,DNA,断裂为非二倍体,TUNEL,：,TdT-dUTP,连接着色,DNA 3,断裂末端,死细胞,细胞因子的检测,生物活性检测法：,CTLL,细胞株,IL-2,依赖,增殖,vs,细胞因子含量,免疫学检测：,ELISA ELISPOT,B,细胞功能测定,Ig,定量：单向琼脂扩散、免疫比浊法、,ELISA,B,细胞增殖试验,抗体形成细胞测定：,溶血空斑实验,吞噬细胞功能测定,趋化功能测定（,Boyden,小室）,吞噬功能测定,硝基蓝四氮唑,NBT,淡黄色经超氧阴离子,O,2,-,变为蓝黑色颗粒,荧光标记的生物颗粒、天然有色颗粒（鸡红细胞）,三、免疫学检测方法的应用,疾病的诊断：,感染性疾病,超敏反应性疾病,自身免疫病,免疫缺陷病,肿瘤,免疫学监测：,免疫学防治,Immunoprophylaxis and immunotherapy,一、,免疫预防,疫苗的基本要求,:,安全 有效 实用,自然免疫：,机体感染病原体后建立的特异性免疫，包括胎儿或新生儿经胎盘或乳汁从母体获得抗体。,疫苗（,vaccine,）：,一些能够诱导机体产生特异性免疫的人工主动免疫制剂如细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素等统称为疫苗。,人工主动免疫,:,用疫苗接种机体使之产生特异性免,疫,从而预防感染的措施。,人工被动免疫：,给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染的措施。,人工主动免疫,减毒活疫苗：免疫原性强，类似轻症感染，只需接种一次。卡介苗、脊髓灰质炎、麻疹、风疹疫苗,灭活疫苗（死疫苗）：免疫原性强，理化灭火，诱导特异性抗体的产生，无法诱导,CTL,，需接种多次。狂犬病、伤寒、流感疫苗,类毒素：细菌的外毒素经,0.3%-0.4%,甲醛处理，诱导机体产生抗毒素。白喉、破伤风,人工被动免疫,抗毒素：用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有中和外毒素的作用。破伤风抗毒素、白喉抗毒素,人免疫球蛋白制剂：从大量混合血浆或胎盘血中分离制成的免疫球蛋白浓缩剂。甲型肝炎、丙型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等疾病的预防,细胞因子和单克隆抗体,佐剂（,adjuvant),：,预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强物质。,增加局部抗原浓度,刺激单核,-,巨噬细胞系统，增强抗原处理和提呈能力,刺激淋巴细胞增殖分化,常用佐剂：,氢氧化铝,ISCOMs,（免疫刺激复合物）,含,CpG,寡核苷酸,细胞因子,新型疫苗,亚单位疫苗： 有效免疫原成分制成的疫苗，如乙型,肝炎病毒表面抗原制成的乙型肝炎疫苗,结合疫苗： 细菌夹膜多糖,+,白喉类毒素 （脑膜,炎球菌、肺炎球菌疫苗已获准使用）,合成肽疫苗：,疟疾疫苗、肝癌疫苗处于临床试验阶段,基因工程疫苗,重组抗原疫苗：乙型肝炎疫苗获准使用重组载体疫苗,DNA,疫苗：用编码有效免疫原的基因与表达质粒构建重,组体直接免疫机体。,转基因植物疫苗：将编码有效免疫原的基因导入可食,用的植物细胞基因组中，使其在植,物的可食用部分稳定表达，通过摄,取食物达到免疫接种的目的。,我国计划免疫程序,疫苗名称,第一次,第二次,第三次,加强,预防传染病,卡介苗,出生,肺结核,乙肝疫苗,出生,1,月龄,6,月龄,乙型病毒性肝炎,脊灰疫苗,2,月龄,3,月龄,4,月龄,4,周岁,脊髓灰质炎,百白破疫苗,3,月龄,4,月龄,5,月龄,18-24,月龄，,6,周岁,百日咳,白喉,破伤风,麻疹疫苗,8,月龄,麻疹,麻腮风疫苗,18-24,月龄,风疹,流行性腮腺炎,乙脑疫苗,8,月龄,2,周岁,流行性乙型脑炎,A,群流脑疫苗,6-18,月龄（,1,、,2,次间隔,3,个月）,流行性脑脊膜炎,A+C,群流脑疫苗,3,周岁,6,周岁,甲肝疫苗,18,月龄,甲型肝炎,以上为儿童免疫规划疫苗，以下为重点人群接种疫苗,出血热双价纯化疫苗,出血热,炭疽减毒活疫苗,炭疽,钩体灭活疫苗,钩体病,许多疾病无有效疫苗：,病毒：,HIV,， 疱疹病毒,细菌：,葡萄球菌，,A,组链球菌,真菌：,假丝酵母,原生动物,：疟疾，利什曼病,蠕虫感染,：血吸虫病,疫苗的应用,传染病,抗肿瘤,计划生育,防止免疫病理损伤,二、免疫治疗,（,Immunotherapy）,利用免疫学原理，针对疾病的发生机制，人为地调整机体的免疫功能，达到治疗母的所采取的措施。,免疫抑制,、,免疫增强,主动或被动,特异或非特异,（一）、分子治疗,分子疫苗：合成肽疫苗、重组载体疫苗和,DNA,疫苗可作为肿瘤和感染性疾病的治疗性疫苗,抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体,3.,细胞因子：外源性细胞因子治疗、细胞因子拮抗疗法、微生物抗原疫苗,4.,微生物抗原疫苗,1）多克隆抗体,在临床应用的多克隆抗体包括：,胎盘球蛋白、丙种球蛋白、破伤风抗毒素、白喉抗毒素、抗淋巴细胞抗血清、抗,Rh,抗体、抗,SARS,病毒抗体等,2）鼠源单克隆抗体,在临床应用的鼠源单克隆抗体：,抗,C,D3（OKT3）：,抗器官移植排斥,抗,C,D20：,治疗,B,细胞淋巴瘤,3）基因工程抗体,基因工程抗体已经成为治疗性抗体的主流产品。包括：,嵌合抗体（,chimeric Ab),人源化抗体（,humanized Ab）,人抗体,抗体药物,基因工程抗体,鼠源单克隆抗体治疗存在的主要问题是,H,AMA（Human anti-mouse antibody）,反应，导致疗效下降，副作用增加。,抗细胞因子及其受体抗体,抗,TNF,及其受体的抗体治疗类风湿关节炎,抗,IL-2,及其受体治疗自身免疫病和抗移植排斥,抗,VEGF,抗体治疗肿瘤,抗,EGFR2、 EGFR1,抗体治疗肿瘤,抗,CD,分子抗体,抗,CD20,嵌合抗体治疗,B,细胞淋巴瘤,抗,CD33,治疗急性髓性白血病,抗,CD52,治疗淋巴瘤,抗,CD11a,治疗银屑病,抗体药物的主要问题,临床用量大,成本高，价格昂贵,生产工艺复杂，硬件设备高投入,治疗性免疫靶标的鉴定有很大难度,存在临床风险,治疗性抗体名称（括号内为商品名）,适应症,肿 瘤,抗,CD20,（,Rituxan,，,Zevalin,，,Bexxar,，,Arzerra,）,非霍奇金淋巴瘤,抗,HER2/CD340,（,Herceptin,）,转移性乳腺癌,抗,CD33,（,Mylotarg,）,急性髓样细胞白血病,抗,CD52,（,Campath,）,B,细胞白血病、,T,细胞白血病和,T,细胞淋巴瘤,抗,EGFR,（,Erbitux,，,Vectibix,）,转移性结肠直肠癌和头颈部肿瘤,抗,RANKL,（,Prolia/Xgeva,）,预防已经转移并损害骨质的肿瘤患者的骨骼相关事件,急性移植排斥反应,抗,CD3,（,Orthoclone OKT3,）,肾移植后急性排斥反应,抗,CD25,（,Zanapax,，,Simulect,）,肾移植后急性排斥反应,自身免疫病和过敏性疾病,抗,TNF,（,Remicade,，,Humira,，,Simponi,）,Crohn,病，类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎、强直性脊椎炎,抗,IgE,（,Xolair,）,持续性哮喘,抗,CD,（,Raptiva,）,斑状牛皮癣,抗,4,整合素（,Tysabri,）,多发性硬化症,抗,VEGF,（,Lucentis,）,年龄相关性黄斑病变,抗,CD45RO,+,（,Amevive,）,银屑病及其他自身免疫紊乱疾病,抗,TNF,（,Cimzia,）,类风湿性关节炎,抗,IL-1,（,Ilaris,）,自身炎症性疾病,抗,IL-12/IL-23,（,Stelara,）,成年患者中度至严重的斑块性银屑病,人源型抗,C5,（,Soliris,）,阵发性睡眠性血红蛋白尿症,其 他,抗,gp,b /,a,（,ReoPro,）,预防冠状动脉血管成形术中发生血栓,抗呼吸道合胞病毒（,Synagis,）,预防儿童在高危期呼吸道合胞病毒感染,抗,IgG,（,OncoScint,）,检测结直肠腺癌和卵巢上皮细胞癌，,诊断乳房癌、肺小细胞癌、胰腺癌、胃癌和食管癌,抗,PSMA,（,ProstaScint,）,评估疑有复发的前列腺患者、用于患者的分期,抗,CEA,（,CEA-Scan,）,检测原发性、结直肠癌转移，乳腺癌淋巴转移,抗肌凝蛋白单株（,Myoscint,）,心肌梗塞引起的胸痛定位、,心肌梗塞和心肌炎的造影,抗,SCLC,抗体片段,-NR-LU-10-Fab,（,Verluma,）,诊断常规方法检查经常无效的小细胞肺癌,抗,CD15,（,NeutroSpec,）,用于阑尾炎疑似患者的鉴别诊断,美国,FDA,已批准生产和临床使用的单克隆抗体（截至,2011,年）,批准上市的,重组,细胞因子药物,IFN,白血病、肝炎、,Kaposi,肉瘤,IFN,类风湿关节炎,、,慢性肉芽肿、生殖器疣,G-CSF,自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、 再生障碍性贫,血,GM-CSF,自身骨髓移植、化疗导致的血细胞减少症、 再生障碍性贫血,Epo,慢性肾衰导致贫血、癌症或癌症化疗导致的贫血,、,失血后贫血,IL-2,癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂,IFN,多发性硬化症,IL-11,放化疗所致血小板减少症,SCF,与,G-CSF,联合应用与外周血干细胞移植,PDGF,糖尿病导致的皮肤溃疡,EGF,外用药治疗烧伤、溃疡（仅在中国上市）,bFGF,外用药治疗烧伤、外周神经炎（仅在中国上市）,TNF,局部灌注治疗晚期骨髓瘤（仅在德国上市）,TNF,突变体 晚期肿瘤,（仅在中国上市）,Tpo,治疗血小板减少症（仅在中国上市）,重组蛋白质药物,批准上市的,重组,可溶性,受体,药物,可溶性,TNF,受体-,Ig（Enbrel）：,治疗类风湿关节炎（,Amgen),2006,年销售额超过,45,亿美元,可溶性,CD152-Ig CTLA4-Ig）:,商品名,Abatacept,，治疗自身免疫病（,Bristol-Myers Squibb）,2005,年12月批准上市,重组蛋白质药物的主要问题,半衰期短，需要反复给药,能够诱导抗体产生,基因治疗,将正常人体基因通过,in vivo,或,ex vivo,的途径导入病人体内，通过体内表达正常基因治疗疾病。,Ashanti de Silva, was the first,patient to be treated with gene therapy.,重症联合免疫缺陷（,SCID,）的基因治疗,腺苷脱氨酶（,ADA,）基因治疗(1990),XSCID,的,IL-2,受体,链基因治疗,性联,SCID,的发病是由于,IL-2R,基因缺陷,2000年法国科学家在,Science,首次报道,2,例成功基因治疗的结果；至,2002,年法、英、美共治疗,14,例，,12,例成功。,第一例成功接受,IL-2R,基因治疗的男孩,Rhys Evans,XSCID,基因治疗原理,基因治疗的主要问题,病毒载体的安全性,靶基因选择,基因导入效率,基因的可调控表达,（二）、 免疫细胞治疗,细胞疫苗：,肿瘤细胞疫苗：灭活瘤苗、异构瘤苗。自体或同种肿瘤细胞经理化方法处理，抑制其生长保留其免疫原性。,基因修饰的瘤,苗：用基因修饰的方法改变肿瘤细胞的遗传性状，降低致瘤性，增强免疫原性,树突状,细胞疫苗：使用肿瘤提取物抗原或肿瘤抗原多肽等体外刺激树突状细胞，或用携带肿瘤相关抗原基因的病毒载体转染树突状细胞，再回输给患者，可有效的激活抗肿瘤免疫应答,取自体淋巴细胞经体外激活、增殖后回输患者，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应，即过继免疫（,Adoptive immunity）,CIK,（cytokine induced killer）:,外周淋巴细胞经,PHA+IL-2+IL-1,等多种细胞因子诱导培养,TIL（tumor infiltrating lymphocyte）,：,肿瘤中,T,细胞经体外,IL-2,诱导培养,过继转移：,移植所用干细胞来自于,HLA,型别相同的供者，采集,CD34+,干细胞,1.,骨髓,2.,外周血,3.,脐血,造血干细胞移植：,免疫细胞治疗的主要问题,疗效不稳定，不同个体反应不同,只能采取个体化治疗，不能工业生产，质量控制有难度,成本高，价格昂贵,种 类,举 例,主 要 作 用,细菌产物,卡介苗、短小棒状杆菌、胞壁酰二肽、二霉菌酸酯海藻糖,活化巨噬细胞、,NK,细胞,合成性分子,吡喃共聚物、马来酐二乙烯醚（,MEV,）、嘧啶、聚肌胞苷酸,诱导产生,IFN,细胞因子,IFN-,、,IFN-,、,IFN-,、,IL-2,活化巨噬细胞、,NK,细胞,激 素,胸腺素、胸腺生成素,增强胸腺功能,（三）、生物应答调节剂和免疫抑制剂,天然动植物药物,免疫增强剂：,黄芪、茯苓、枸杞等,生物应答调节剂：,具有促进或调节免疫功能的制剂，通常对免疫功能正常者无影响，而对免疫功能异常，特别是免疫功能低下者有促进或调节作用,免疫抑制剂,化学合成药物,糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤,2.,微生物制剂,环孢素,A,（,CsA),、,FK506,、麦考酚酸酯、雷帕霉素,3.,来源于动植物的免疫抑制剂,苦参、雷公藤等,常用于防止移植排斥反应的发生和自身免疫病的治疗,谢谢！,
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