选修一：2-2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,课题,2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课程标准,测,定某种微生物的数量。,课标解读,1.,利,用选择培养基分离细菌。,2.,运用活菌计数法测定土壤中尿素细菌的数量。,1,筛选菌株,(1),自,然界中目的菌株筛选的依据是根据它对,的要求，到相应的环境中去寻找。,(2),实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于,生长的条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时,或,其他微生物生长。,微生物的分离与计数,生存环境,目的菌株,抑制,阻止,(3),选择培养基：在微生物学中，将允许,种类的微生物生长，同时,和,其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。,2,统计菌落数目,(1),常,用方法：,法。,(2),统计依据：当样品的,足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个,。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌。,(3),平板选择菌落计数时一般选菌落数在,的平板，计数公式为,。,特定,抑制,阻止,稀释涂布平板,稀释度,活菌,30,300,每克样品中的菌落数,(CV),M,3,设置对照,(1),对,照实验：是指除了,以外，其他条件都相同的实验。,(2),主要目的：排除实验组中,对实验结果的影响，提高实验的可信度。例如为了确认培养基是否被杂菌污染，需以,培养基培养作为空白对照。,被测试因素,非测试因素,牛肉膏蛋白胨,思维激活,1,上,述的对照组培养基,(,牛肉膏蛋白胨培养基,),是否也需接种？如何确认所制备的选择培养基的确起到了选择作用？,提示,为确认培养基是否被杂菌污染时，对照组的牛肉膏蛋白胨培养基不需接种。欲确认所制备的选择培养基是否起到了选择作用，应同时对对照组的牛肉膏蛋白胨培养基进行接种,若对照组培养基中菌落种类明显复杂于实验组，则可确认选择培养基的确起到了选择作用。,1,选择培养基的制作方法,(1),在,培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。,(2),通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的,CO,2,制造有机物生存。,(3),利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。,(4),通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。,2,结果分析与评价,内容,现象,结论,有无杂菌污,染的判断,对照的培养皿中无菌落生长,未被杂菌污染,培养物中菌落数偏高,被杂菌污染,菌落形态多样，菌落数偏高,培养物中混入其他杂菌,选择培养基,的筛选作用,牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目,选择培养基具有筛选作用,样品的稀释,操作,得到三个或三个以上菌落数目在,30,300,的平板,操作成功,重复组的结果,若选取同一种土样，统计结果应接近,特别提示,(1),不同细菌的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，可以作为菌种鉴定的重要依据。,(2),进行活菌计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。,(3),选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。,【,巩固,1,】,苯,酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，,为土壤样品。请回答下列问题。,(1),中培养目的菌株的选择培养基中应加入,_,作为碳源，,中不同浓度碳源的培养基,_(A.,影响；,B.,不影响,),细菌的数量，如果要测定,中活细菌数量，常采用,_,法。,(2),为对照，微生物在,中不生长，在,中生长，,与,培养基的主要区别在于,_,；使用,_,法可以在,上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是,_,_,。,(3),实验过程中如何防止其他微生物的污染？,_,。,解析,根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长，抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落，再接种培养即可获得纯目的菌。为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长，所以要将培养皿倒置。在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则，操作中要严格进行无菌操作。,答案,(1),苯,酚,A,稀释涂布平板,(2),的培养基没有加入苯酚作为碳源，,的培养基加入苯酚作为碳源稀释涂布平板法或平板划线以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基,(3),培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作,1,实验设计,(1),土,壤取样,土壤微生物大约,70%,90%,是,。,细菌适宜在酸碱度,的,土壤中生长，绝大多数分布在距地表,的土壤层。,土壤中分解尿素的细菌的分离计数实,验操作与评价,细菌,接近中性,潮湿,3,8 cm,(2),样品处理,样品的,直接影响平板上生长的,，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数在,之间，便于计数。,(3),微生物的培养与观察,将培养基平板放置于,温室中培养,1,2d,，每隔,统计一次,数目，最后选取数目,时的记录作为结果。,(4),细菌的计数,当菌落数目稳定时，取同一条件下的至少,个平板进行计数，求出,，并根据所对应的,计算出样品中细菌的数目。,稀释程度,菌落数目,30,300,30,37,24h,菌落,稳定,3,平均值,稀释度,2,操作提示,(1),无,菌操作,取土样的用具在使用前都需要,。,应在,旁称取土壤。并在,附近将土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在,旁操作。,(2),做好标记,本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就,。,灭菌,火焰,火焰,火焰,做好标记,3,课题延伸,细,菌合成的,将尿素分解成,，使培养基的,增强。在以,为唯一氮源的培养基中加入,指示剂培养细菌，若指示剂变,，可确定该种细菌能够,。,脲酶,氨,碱性,尿素,酚红,红,分解尿素,思维激活,2,分离尿素细菌的培养基为何能起到选择作用？,提示,微生物的生长需要氮源，大多数微生物不能直接利用尿素作氮源，但尿素细菌却可以尿素作氮源，因此，在以尿素为唯一氮源的培养基中，唯有能利用尿素的微生物方可生长繁殖，其他微生物则不能生长繁殖而被淘汰，因而该培养基可起到筛选尿素细菌的作用。,1,土壤中分解尿素的细菌的分离,(1),分,离的原理,土壤中的细菌之所以能够分解尿素，是因为它们体内能合成脲酶。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。,实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时抑制或阻止其他微生物生长。,分离分解尿素的细菌的培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。,(2),尿素细菌分离与计数的实验流程：,土壤取样,样品稀释,取样涂布,微生物培养,观察并记录结果,细菌计数,2,统计菌落数目的方法,(1),显,微镜直接计数法,原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。,方法：用计数板计数。,缺点：不能区分死菌与活菌。,(2),间接计数法,(,活菌计数法,),原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,操作,a,设置重复组：同一稀释度下，至少涂布,3,个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果明显不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,b,为了保证结果准确，一般选择菌落数在,30,300,的平板进行计数。,计算公式：每克样品中的菌株数,C/V,M,，其中,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,/,mL,，,M,代表稀释倍数。,【,巩固,2,】,分,离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是,(,),。,加尿素,不加尿素,加琼脂,不加琼脂,加葡萄糖,不加葡萄糖,加硝酸盐,不加硝酸盐,A,B,C,D,解析,土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中只加尿素，分解尿素的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培养基；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖作为碳源。,答案,C,【,巩固,3,】,用,来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是,(,),。,A,未接种的选择培养基,B,未接种的牛肉膏蛋白胨培养基,C,接种了的牛肉膏蛋白胨培养基,D,接种了的选择培养基,解析,将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。,答案,C,【,例,1,】,尿,素是一种重要的农业肥料，但若不经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌,(,目的菌,),。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题。,微生物的分离,(1),培养基中加入尿素的目的是筛选,_,，这种培养基属于,_,培养基。,琼脂,15 g,尿素,1 g,葡萄糖,10 g,MgSO,4,7H,2,O,0.2 g,Na,2,HPO,4,2.1 g,KH,2,PO,4,1.4 g,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到,100,mL,(2),“,目的菌,”,生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的,_,和,_,，实验需要振荡培养，原因是,_,。,(3),转为固体培养基时，常采用,_,的方法接种，获得单菌落后继续筛选。,(4),下列材料或用具：,培养细菌用的培养基与培养皿；,玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；,实验操作者的双手。其中需要灭菌的是,_,；需要消毒的是,_,。,(,填序号,),(5),在进行分离分解尿素的细菌的实验时，,A,同学从培养基上筛选出大约,150,个菌落，而其他同学只筛选出大约,50,个菌落。,A,同学的实验结果产生的原因可能有,_,。,(,填序号,),由于土样不同,由于培养基污染,由于操作失误,没有设置对照,思维导图：,深度剖析,(1),培养基中加入尿素的目的是筛选尿素细菌。,(2),尿素可为尿素细菌提供氮源，震荡可为目的菌株提供氧气。,(3),在固体培养基中接种常用稀释涂布平板法和平板划线法。,(4),操作器械需灭菌，操作者双手需消毒。,(5),土样不同、培养基污染、操作失误均可能导致计数误差。,答案,(1),目,的菌选择,(2),尿素葡萄糖为目的菌提供氧气,(3),稀释涂布平板,(,平板划线,),(4),和,(5),思维拓展,(1),利用选择培养基设计实验分离纯化微生物。,真菌：用含青霉素的培养基分离。,金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。,固氮微生物：用无氮培养基分离。,自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。,光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。,厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。,乳酸菌：用乳酸含量较高，,pH,较低的普通培养基分离。,假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。,(2),微生物分离与计数中两种对照组的作用：,判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。,【,例,2,】,下,列是关于,“,检测土壤中细菌总数,”,实验操作的叙述中，错误的是,(,),。,A,用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板,B,取,10,4,、,10,5,、,10,6,倍的土壤稀释液和无菌水各,0.1,mL,，分别涂布于各组平板上,C,将实验组和对照组平板倒置，,37,恒温培养,24,48h,D,确定对照组无菌后，选择菌落数在,300,以上的实验组平板进行计数,微生物的计数,思维导图：,深度剖析,确定对照组无菌后，选择菌落数在,30,300,的平板进行计数，,D,错；,A,是培养基的灭菌方法，,B,设置了一系列对照实验，,C,是细菌的培养方法，,A,、,B,、,C,三个选项均是正确的。,答案,D,旁栏思考题,1,想,一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,答案,统,计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计,3,个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。,2,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,答案,这,是因为土壤中各类微生物的数量,(,单位：株,/kg),是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为,2 185,万，放线菌数约为,477,万，霉菌数约为,23.1,万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不相同。,