细菌总数的测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 细菌总数的测定,纯种分离,一、目的,1.,掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。,2.,掌握无菌操作技术。,二、材料和器皿,1.,扭力天平、取土样工具、涂布棒,(,接种棒,),。,2.,无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。,3.,无菌水。,4.,培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。,1,、取土样,选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约,2cm,的土壤，将铲子插入土中数次，然后取,2,10cm,处的土壤。,盛土的容器应是无菌的。将,5,点样品约,1kg,充分混匀，除去碎,石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取,10-,15g,，称重后经,105oC,烘干,8h,，置于干燥器中冷却后再次称重，,计算含水量。,三、实验操作步骤,2,、倒平板,熔化已灭菌的上述,4,种培养基并冷却至,45oC,左右倒平,板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。,3,、编号,取,5,支无菌空试管（,15,150mm,）依次编号为,10,-3,、,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,、,10,-7,。,4,、分装无菌水,按无菌操作用,5mL,移液管分别吸取,4.5mL,无菌水于编号的,各无菌空试管中。,5.,制备土壤稀释液,称土样,1g,于盛有,99mL,无菌水或无菌生理盐水并装有玻,璃珠的三角瓶中，振荡,10,20min,，使土样中的菌体、芽孢,或孢子均匀分散，此即为,10-2,浓度的菌悬液。用无菌移液,管吸取悬液,0.5mL,于,4.5mL,无菌水试管中，用移液管吹吸三,次、摇匀，此即为,10-3,浓度。同样方法，依次稀释到,10-,7,。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，整个稀释,过程如图。,样品的处理和稀释,操作要求：,“无菌操作”贯彻始终。,充分振摇或研磨,25g,或,25ml,检样,225mL,稀释液,含有玻璃珠的灭菌玻璃瓶或乳钵,1,：,10,稀释液。,1ml,1ml,1ml,9ml,稀释液,1,：,100,9ml,稀释液,1,：,1000,9ml,稀释液,1,：,10000,减少误差：每递增稀释一次即换用,1,支,1ml,灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，,勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。,环境要求：,琼脂平板在工作台暴露,15,分钟，每个平板不得超过,15,个菌落。,代表性：,取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；,液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。,稀释样品的取样和倾注平皿,每个稀释度,做两个平皿,将凉至,46,营养琼脂培养基注入平皿约,15ml,，,并转动平皿，混合均匀。,取样,倾注平皿,1,：,10,稀释液,225mL,无菌水,1mL,1mL,9mL,稀释液,1,：,100,9mL,稀释液,1,：,1000,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1ml,无菌水,25g,或,25ml,检样,6,、,培养及计数,培养条件：倒置于,36,1,温箱内培养,48,2h,计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放,置于,0,4,，但不得超过,24h,。,菌落总数报告方式,计平皿中菌落数：,肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀,释度的各平板平均菌落数。,规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落,数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈,多。,如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现,象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。,当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于,300,时），但分布很均匀，可取平板的一半或,1/4,计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘,2,代表全平板的菌落数。,菌落总数报告方式,计数原则：,选平均菌落数在,30300,之间者进行计算,2.,若有,2,个稀释度的平均菌落数在,30300,之间时，则按两者的菌落总数之比来决,定，若比值小于,2,应报告两者的平均数；若大于,2,则报告其中较小的菌落总数。,3.,若所有稀释度的平均菌落数均大于,300,，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍,数报告之。,4.,若所有稀释度的平均菌落数均小于,30,，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀,释倍数报告之。,5.,若所有稀释度的平均菌落数均不在,30300,之间，则以最接近,300,或,30,的平均菌,落数乘以稀释倍数报告之。,6.,若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。,7.,在求同稀释度的平均数时，若其中,1,个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜,采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约,为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，,然后乘以,2,作为整个平板的菌落数。,1.,仅,1,个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报,告之。,报告原则,菌落总数报告方式,例次,不同稀释度的平均菌落数,两个稀释度菌落数之比,菌落数,(,个,/,mL,),报告方式,(,个,/,mL,),10,-1,10,-2,10,-3,1,1365,164,20,16400,16000,或,1.610,4,2,2760,295,46,1.6,37750,38000,或,3.810,4,3,2890,271,60,2.2,27100,27000,或,2.710,4,4,无法计数,4650,513,513000,510000,或,5.110,5,5,27,11,5,270,270,或,2.710,2,6,无法计数,305,12,30500,31000,或,3.110,4,7,无法计数,10,-3,无法计数,7,、,菌落总数报告方式,菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在,1100,时，按实有数字报告，如大于,100,时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用,10,的指数来表示。,固体检样以克（,g),为单位报告，液体检样以毫升（,mL,）,为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（,cm,2,）,报告。,8.,计数,选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀,释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在,30,300,之间的平皿，霉菌选菌落数在,10,100,之间的平皿，最后换,算成每克干土所含菌数。,同一稀释度的平均菌落数,稀释倍数,每克干土含菌数,=,1,土壤含水量,四、思考题,用一根无菌移液管接种几个浓度的水样时应从,哪个浓度开始？为什么？,2.,琼脂平板接种后，为什么要倒置培养？,