《让质粒鲜活起来》PPT课件

Tankertanker Design,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Tankertanker Design,Tankertanker Design,让,质粒鲜活,起来,生物技术102班 第二小组,成员：华璐、钟依依、苗舒、,庄思静、章辉辉,质,粒,的,概念,质粒是一类亚细胞有机体，结构比病毒还要简单，既,没有蛋白质外壳,，也,没有细胞外的生命周期,，却能在宿主细胞中,独立地增值,，并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去。,Plasmid,目录,CONTENTS,基本性质,主要类型,提取方法,异同分析,质粒的基本性质,质粒分子的构型多样、大小不一,1,质粒的自主复制性和可扩增性,2,质粒的可转移性,3,质粒的不相容性,4,质粒分子的构型多样、大小不一,共价封闭环状DNA，即SC构型。,开环DNA，称作OC构型。,线形DNA，即L构型,1,2,3,除了,酵母的杀伤质粒,是一种,RNA质粒,外，目前发现的质粒,都是,以,DNA,方式存在的。,质粒的自主复制性和可扩增性,根据质粒复制与宿主菌相关程度不同，可将质粒分为,严谨型质粒,和,松弛型质粒,（常被选为基因工程载体）,严谨型质粒通常是一些,具有自身传递能力,的,大质粒,，其复制与宿主菌,密切相关,。,松弛型质粒通常是,分子量较小,，,不具传递能力,的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，且,不受,宿主菌蛋白合成的,影响,。,质粒的可转移性,质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。,根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，质粒可分为,接合型质粒,和,非接合型质粒,两类。,质粒的不相容性,质粒的不相容性有时也称质粒的,不亲和性,，它是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，,不能,在同一个宿主细胞系中,稳定共存,的现象，这样的两种质粒称为不亲和质粒。,No.1,主要依赖天然存在的质粒,No.2,人工构建一批分子量相对较小、拷贝数较多、具特殊功能的质粒载体,No.3,主要借助于一些辅助序列引入新的功能,质粒研制与发展的三个阶段,常用的几种质粒,pBR322质粒载体,这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载体，有,万能质粒,之称。,pUC质粒载体,它实际上是由pBR322质粒载体改造而来的一系列质粒载体的总称。它包括有pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18等。,Pvu,2067,pBR322质粒载体结构图,pUC18质粒载体结构图,pUC系列质粒载体的优点,与pBR322质粒载体相比，pUC系列质粒载体具有许多,优越性,：,（1）具有更小的分子量和更高拷贝数。,（2）由于具有来自大肠杆菌lac操纵子lacZ的基因，它所编码的,肽链可参与互补作用，可用于组织化学方法检测重组体。,（3）具有多克隆位点MCS区段。,质粒的提取,在提出的许多用于从细菌中提纯质粒DNA的方法中都含有以下3个步骤:,（1）细菌培养物的生长。,（2）细菌的收获和裂解,（3）质粒DNA的纯化。,提取的方法,质粒DNA的提取方法主要有,：,碱裂解法,（此方法适用于,小量质粒DNA,的提取，提取的质粒DNA可,直接用于,酶切、PCR扩增、银染序列分析）,煮沸法,酚氯仿裂解法。,碱裂解法,1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。,2.37振荡培养过夜。,3.取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。,4.加0.lml,溶液I,(1葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。,5.加入0.2ml,溶液 II,(0.2 mM/L NaOH，1 SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。,6.加入0.15m1预冷,溶液III,(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。,7.以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管,8.加入,等体积,的,异戊醇,，混匀后于0静置10min。,9.再以10，000rpm离心20min，弃上清。,10.用70,乙醇,0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。,11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中,相关试剂的作用,（一）,溶液I,，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0,主要作用,是：调节反应液pH，使大肠杆菌悬浮于反应液中，螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。,（二）,溶液II,，0.2 N NaOH/1%SDS,主要作用,是：两者共同作用，使细胞溶解（其中,NaOH为主,，,SDS为辅,）。,（三）,溶液III,，3 M 醋酸钾/2 M 醋酸,主要作用,是：使钾离子置换SDS中的钠离子而形成不溶性的PDS，同时高浓度的盐，使得沉淀更加完全。,（四）,异戊醇,主要作用,是：为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。,（五）,乙醇,主要作用,是：进一步沉淀质粒DNA，去除残留的盐。,质粒提取,基因组提取,提取,步骤基本上,都属DNA的提取,步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解,提取中有一个DNA变性、复性的过程，整个过程较为,简单,，,用时短,。,没有DNA变性、复性的过程，对有些革兰氏阳性菌要进行溶菌酶处理，整个,过程更复杂,，,耗时更长,。,与基因组提取的异同,Thank you!,