发酵机制-mcah和mfa23-24节

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,代谢工程,1:,metabolic control analysis (MCA),代谢控制分析,葡萄糖,丁二醇、丙酸、乳酸等,丙酮酸,乙醛,乙醇,乙酰,CoA,乙醇 或乙酸,三羧酸循环,各种氨基酸、细胞组成产物、代谢产物等,method,1:,metabolic control analysis (MCA),代谢控制分析,人们采取某种措施控制胞内通量分布来找到那些对产物合成有重要影响的,关键分支点和关键酶,，研究个体酶的动力学性质，分析酶促反应对代谢通量的敏感性，从而控制通量分布。,MCA,是研究分析代谢途径中代谢控制在各个反应步骤之间如何分配的理论。可以用数学形式表达，并与实验方法相结合，对细胞代谢的调控问题提出定量的解释。,MCA,的 基本理论,MCA,的基本研究对象是由,代谢反应步骤,和,代谢反应途径,组成的代谢系统，,单个反应步骤是组成系统的基本单元,。,MCA,认为代谢系统中所有反应步骤都对代谢通量和代谢物浓度进行,控制,因此对其中,一个反应步骤,施加微扰,而产生的代谢通量（或代谢物浓度）变化的大小,，可以作为代谢系统分析理论的,基本概念,。再结合直线式代谢系统的结构约束条件，可以导出,总和原理和连通原理,。,）,控制系数,是对代谢系统中某一步反应施加一个,微小扰动,，所引起代谢通量或代谢物浓度的相对变化与该反应的反应速度,v,相对变化之比，即：,C,A,=(dA/A)/(dv/v),式中,A-,代表代谢通量，,C,A,-,通量的控制系数。,例如：,A,代表代谢物的浓度，则,C,A,为该步骤代谢物的浓度控制系数。,表示每一步骤对控制作用的强弱。越小越好。,）,弹性系数,是指对某一步反应的某一参数,p,（如底物、产物、酶浓度、温度、效应物等）进行微扰，所引起的反应速度,v,i,的相对变化与参数的相对变化之比。,弹性系数,=(dv/v)/(dA/A),，,即越大越好，即对反应的影响越大。,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,代谢控制分析定义,通量控制系数、浓度控制系数、弹性系数等,表征参数，通过对它们进行比较即可找到,限制性步骤和关键酶,，为代谢工程提供,目标,位点。,常用的是一种基于,扰动,-,响应的方法,，即通过基因工程手段或加入抑制剂改变特定酶的水平或活性，或者改变环境条件,如,底物、中间化合物、产物,浓度等的改变，考察其对通量分布的影响而求得各个参数。,MCA,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,总之，随着理论研究的深入，已发展到可以对含有,分支途径、循环、酶,-,酶相互作用、级联反应,等各种结构形式的代谢系统进行代谢控制分析。,2.,metabolic flux analysis(,MFA,代谢通量分析,),用于分析：确定分支途径的,优先合成,以及发现其它分支途径。,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,MFA,是根据代谢路径中各反应的计量关系、,某些底物、产物的通量,及细胞组成等确定整个代谢网络的,通量分布,。,该方法的基础是,准稳态假设,：假设细胞内的,中间代谢物均处于准稳态,，即浓度不变，可由,n,个中间代谢物得到,n,个关于速率的约束条件,而速率的总数目为,J,，则待解问题的自由度为,F=J-n,。这样通过实验测出,F,个不相关速率,就求出整体通量分布。前提是对,细胞内代谢路径,有清楚的了解，尤其是各个分支点,。,2,MFA,代谢,通量分析,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,下式为计算代谢物质量平衡的化学计量方程：,Ar(t)+b(t)+Rmb=0,式中：,A,为系数矩阵，,r(t),为反应速率向量，,b(t),为,代谢物积累速率,，,Rmb,为残差向量。,其中,b(t),分为胞外代谢物积累速率和胞内代谢物积累速率之和，前者可通过测量获得，后者根据准稳态假设为零,。只需测量几个胞外速率或其它约束条件，就可以计算出胞内各代谢反应速率。,MFA,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,schulnze,将,MFA,的应用归纳为,6,点：,1,）计算细胞内部通量分布；,2,）计算某些难以直接测量的外部量的变化速率；,3,）确定代谢路径中,刚性节点及控制步骤,；,4,）计算,理论得率,；,5,）确定胞内代谢路径；,6,）分析替代路径对通量分布的影响。,代谢流分析在微生物培养中应用比较广泛，,它有助于理解细胞各代谢途径的特点，并提供代谢调控或优化的信息,，可,通过同位素标记及核磁共振来测定,NMR,。这种方法的缺点是测定费用,昂贵,。,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,而简单方法是通过,测定细胞外代谢物及菌体组成,，根据物料平衡和已知的代谢途径来计算。由于细胞代谢网络的复杂性，通常不能得到唯一解，即局限性。,可能的解决方法，一是,合并反应，减少变量个数,；二是通过共谢物的测定来确定,循环反应的流量,；三是利用线性规划的方法来求得,最优化解,。,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,总之，通过代谢机制分析，提高目的产物产率：,1,）,强化目的产物生成途径,，如提高关键酶活,2,）,打断或减弱分支途径,，减少副产物或次级代谢产物。,3,）,构建新途径,合成产物或中间化合物，,4,）,阻断产物的分解或利用,。,5,）,提高细胞膜通透性,，分泌出产物，以及提高菌种耐受性。,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,辅酶,Q10,作为细胞呼吸链上的重要组成部分，抗氧化、抗衰老功能使其广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。,自然界筛选的各种微生物作为生产菌种发酵生产,CoQ10,具有产量低、营养要求、难规模化生产。,MCA,、,MFA,例子,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,吴祖芳等研究发现,CoQ10,的生物合成很大程度上取决于,CoQ10,生物合成途径中催化,DPP(,聚十异戊二烯焦磷酸,),的合成和,PHB(4-,羟基苯甲酸,),与,DPP,的缩合反应,的,两种关键酶,活性。,1.,提高通向目标产物代谢流,的手段,:,增强催化限速反应的酶的,表达量或活性,从而提高代谢流,;,在有竞争途径或者是分支代谢途径存在时,阻断有害的或无关的竞争代谢途径的代谢产物合成,从而达到改变代谢流,提高目标产物产量的目的,;,强化整个代谢途径,的代谢流量,使得目标产物含量增加,。,染菌的防止,CoQ10,生成途径,培养基与设备灭菌,限速酶,-4-,羟基苯甲酸,-,聚异戊二烯焦磷酸转移酶,主要负责催化,pHB,与,PPP,的缩合反应。该酶专一性不强,在,E.coli,中主要是由,ubiA,基因编码,;,在,Saccharomyces cerevisiae,中由,coq2,基因编码,;,在,S chizosaccharomy ces pombe,由,ppt1,基因编码。,Zhang,等将来自,E.coli,、,S.cerevisiae,、,S.pombe,的,ub iA,、,coq2,、,ppt1,基因转化到,A.tumefaciens,中,结果发现能够表达,ubiA,、,coq2,、,ppt1,基因的重组,A.tumefaciens,的,CoQ10,的含量得到较大提高。,5-,磷酸脱氧木酮糖合成酶,(DXS),是,MEP,代谢途径上合成,DPP,的限速酶。通过在,E.coli,中过量表达来自,P seudomonas aerug inosa,Bacillus subtilis,或,Synechocy stissp.6803,的,DXS,基因,可以使得大肠杆菌的,CoQ,合成量得到提高。,线状的,DNA,侵入大肠杆菌,K12,细胞内时，首先环合成为环状,DNA,，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由,DNA,连接酶封闭。,噬菌体感染了寄主细胞之后，,DNA,可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由,C,I,基因和,cro,基因编码的蛋白质同,噬菌体的两个操纵基因（,OL,，,OR,）之间的相互作用来决定，参见图,3-11,。,2,噬菌体,DNA,复制,2.,阻断有害的或无关的竞争代谢途径,一些物质,(,包括芳香族氨基酸、叶酸、细菌萜醇等,),与,C